王子堅,賀奮義,郭慧琳,魏潤生(甘肅省動物疫病預防控制中心,甘肅 蘭州 730046)
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非洲豬瘟檢測技術研究進展
王子堅,賀奮義,郭慧琳,魏潤生
(甘肅省動物疫病預防控制中心,甘肅 蘭州730046)
摘要:非洲豬瘟是一種外來疫病,在我國存在輸入性風險。本文介紹了非洲豬瘟幾種診斷方法的研究進展,為該病的診斷和有效防控提供了理論依據(jù)。
關鍵詞:非洲豬瘟;鑒別診斷;檢測技術
非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)又稱非洲豬瘟疫,是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)感染引起的一種嚴重危害豬及野豬的動物傳染病,其病程短,死亡率高達100 %。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織(OIE)要求報告的動物疫病,在我國動物病原微生物名錄中列為一類動物疫病[1-3]。我國目前尚未有發(fā)生本病的報道,但由于我國是以農業(yè)為主的養(yǎng)豬大國,國際貿易往來頻繁,存在輸入性風險。因此,掌握ASF診斷方法,對防止ASF的傳入具有重要意義。
非洲豬瘟綜合癥狀復雜,在臨床上難以和豬瘟區(qū)別診斷。豬感染ASFV后雖可產生特異性抗體,但這些抗體沒有中和作用,也缺乏有效的保護性。耐過豬對同型毒株的有抵抗力,但對異源毒株極為敏感,至今仍沒有可預防的疫苗??鼓骸⑵⒑土馨徒Y等是用于診斷非洲豬瘟的常用材料。送檢樣本時應盡量冷藏或浸于甘油鹽水中。根據(jù)流行病學、臨診癥狀和病理剖解可對ASF做初步診斷,確診可通過病原學檢測、血清學檢測和分子生物學檢測[4,5]。
1.1 非洲豬瘟的臨床癥狀
豬感染ASFV后的潛伏期一般為5 d~15 d,根據(jù)感染毒株毒力的不同,臨床癥狀可分為最急性、急性、亞急性和慢性四種類型。最急性型由強毒株感染引起,常無臨床癥狀突然死亡,死亡率高達100 %。急性型病豬體溫40.5 ℃~42 ℃,以高熱、出血和高死亡率為特征,精神沉郁,食欲減退,運動失調,局部皮膚發(fā)紅或發(fā)藍、可視黏膜潮紅、眼有分泌物、嘔吐、腹瀉、咳嗽、呼吸困難和懷孕母豬流產等癥狀,死亡率可達100 %。亞急性型由中等毒力毒株感染引起,癥狀較輕,病死率較低,間斷性發(fā)熱持續(xù)1個月之久,呼吸窘迫、關節(jié)疼痛、腫脹,懷孕母豬常常流產。慢性型由低毒力毒株感染引起,除波狀熱、生長減慢、發(fā)育遲緩或瘦弱外,不表現(xiàn)明顯的癥狀。
1.2 非洲豬瘟實驗室檢測
1.2.1 非洲豬瘟的病原學檢測
非洲豬瘟病原學診斷主要包括病毒分離、熒光抗體試驗(FAT)、雙抗體夾心ELISA等診斷技術。
病毒分離:非洲豬瘟病毒的分離要在具有三級生物安全(BSL-3)以上的生物安全實驗室中進行,分離樣本可以是豬血液及器官組織,包括脾臟、肝臟、肺臟及心臟。豬外周血單核細胞是常用的初次分離病毒的細胞,感染ASFV時,單層豬外周血單核細胞具有血細胞吸附特性及細胞死亡,以此來指示分離的病毒呈陽性。
熒光抗體試驗(FAT):非洲豬瘟抗原能夠與標記有熒光素的抗ASFV特異性抗體相結合,用于野外可疑豬或實驗室接種豬病變組織的ASFV抗原檢測,也可以用于鑒定無紅細胞吸附能力的毒株及區(qū)分非洲豬瘟病毒和偽狂犬病毒在細胞上形成的細胞病變。雖然該方法檢測快速、敏感性和特異性都高,但是由于實驗需要昂貴的熒光顯微鏡和高質量的熒光標記抗體,再加上熒光素標記技術要求高,需要專業(yè)實驗員,目前該方法僅作為診斷ASFV的輔助檢測方法。
雙抗體夾心ELISA:特異性單克隆抗體包被酶標板,加入待檢樣本后,如果樣本中含有目的抗原,則抗原與單抗特異性結合,再加入抗原另一表位的酶標單抗,形成類似雙抗體夾心復合物,加入底物顯色后指示抗原的存在。Vidal等以抗非洲豬瘟病毒抗原性結構蛋白VP73蛋白的特異單克隆抗體為基礎建立了夾心ELISA方法。INGENASA夾心ELISA試劑盒,以包被的P72(又稱P73)單抗檢測樣本中的病毒抗原,可以檢測血液及多種組織中的病毒抗原,特異性、敏感性均很好,是OIE指定的ASFV檢測試劑盒。算,從而評價陽性樣本抗體含量及結合力,與間接ELISA或夾心ELISA結果相反,顯色反應后陽性樣本檢測孔呈色淺,OD值低。該方法的出現(xiàn)為非洲豬瘟的診斷提供了一種無感染性的實驗室診斷方法,特別是對于還沒有發(fā)生非洲豬瘟疫情的國家來講更具有現(xiàn)實意義,INGENASA阻斷ELISA試劑盒,以VP73病毒蛋白為包被抗原檢測非洲豬瘟特異抗體,為OIE指定參考的非洲豬瘟診斷試劑盒。
1.2.3 分子生物學檢測方法
1.2.2 血清學檢測方法
血清學檢測方法有間接免疫熒光試驗、血凝試驗、競爭ELISA或阻斷ELISA等。
免疫熒光試驗的優(yōu)點是敏感性高和快速,但難以實現(xiàn)對樣本的大批量檢測,且自動化程度不高。FAT的優(yōu)點是簡單、特異,靈敏。但是熒光素存在非特異性染色的弊端,導致試驗結果出現(xiàn)假陽性。所以FAT被OIE列為檢測ASF的輔助方法。
血凝試驗具備的優(yōu)點是靈敏度高,可以有效地降低假陽性率,可靠性強。缺點是費時,不易操作,對紅細胞的新鮮度有要求,實驗效果也受到細胞形態(tài)的直接影響,而且非血球吸附的毒株會導致假陰性,有一定的局限性,故該方法很難在ASF感染的早期做出檢測,只能作為輔助檢測。
競爭ELISA或阻斷ELISA:利用待檢血清樣本與特異酶標單抗同時或先后與包被抗原結合反應,如果待檢血清當中含有針對抗原的特異性抗體,將會抑制包被抗原與單抗的結合,樣本抑制率根據(jù)陰陽性樣本的OD值計
核酸檢測:基于多聚酶鏈式反應(PCR)的核酸檢測技術,具有易操作、敏感性高、特異性強、對樣本要求不高等優(yōu)點,能夠實現(xiàn)早期診斷,是非疫區(qū)檢測疫病的重要手段之一。根據(jù)ASFV基因組中含有的高度保守基因序列設計特異性引物進行擴增達到ASFV核酸的檢測目的。PCR技術不僅快速、靈敏,而且對檢測樣本來源要求較低,組織、血液、分泌物等都可以作為ASFV DNA的檢測樣本,能從出現(xiàn)臨床癥狀前病豬采集的樣本中檢測病毒DNA,實現(xiàn)早期診斷。
隨著分子生物學的發(fā)展,熒光定量PCR、多重PCR技術以及新興的環(huán)介導恒等溫核酸擴增技術(LAMP)等方法較普通PCR技術在ASFV核酸檢測方面顯示出了巨大的優(yōu)勢,并日益得到廣泛的應用。
目前,成熟的PCR檢測方法主要選取ASFV的P72基因作為目的基因,根據(jù)不同毒株P72基因的高度保守序列設計出引物,抽提樣本中病毒的DNA作為模板,建立的PCR方法能夠有效地檢測出脾臟等組織中的病毒。John McKillen等建立的PCR方法,可以鑒別診斷出ASF和古典豬瘟[6]。在此基礎上,Mckillen還建立了Real-time PCR,與普通PCR相比,其靈敏度和特異性更強,對樣本中的核酸可以做到實時定量檢測,同時可有效降低電泳過程中瓊脂糖凝膠對PCR結果的影響,結果更加直觀。國內的蔣正軍、孫懷昌等也建立了Taq Man探針,取得了良好的效果。但該方法的缺點是定量PCR儀價格昂貴,成本較高,對試驗耗材要求高,偶爾會產生假陽性的結果。
Bastos等通過設計的兩對引物,建立了巢式PCR,再次從普通PCR檢出結果為陰性的60份樣本中,檢測出近20份陽性[7]。該方法也可用于檢測軟蜱體內的ASFV,靈敏度良好。在靈敏度方面,相比于傳統(tǒng)的病毒分離法和OIE的PCR方法,Bastos等建立的巢式PCR更有優(yōu)勢。江彥增等建立了ASFV的等溫環(huán)介導擴增法,在爆發(fā)疫情的野外和不具備試驗條件的地區(qū),該方法亦可對ASFV進行檢測[8]。
隨著非洲豬瘟在我國周邊國家和地區(qū)的發(fā)生與流行,提示我們必須加強對非洲豬瘟的防控工作,對非洲豬瘟的診斷技術要不斷研究,盡快開發(fā)出可鑒別非洲豬瘟的快速、特異且敏感的診斷方法,這些對預防和控制非洲豬瘟在我國的流行具有十分重要的意義。□□
參考文獻:(10篇,略)
中圖分類號:S828.28
文獻標識碼:A
文章編號:1001-0769(2016)01-0048-02