王子堅(jiān)，賀奮義，郭慧琳，魏潤(rùn)生(甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州　730046)

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非洲豬瘟檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王子堅(jiān)，賀奮義，郭慧琳，魏潤(rùn)生
(甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州730046)

摘要：非洲豬瘟是一種外來(lái)疫病，在我國(guó)存在輸入性風(fēng)險(xiǎn)。本文介紹了非洲豬瘟幾種診斷方法的研究進(jìn)展，為該病的診斷和有效防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；鑒別診斷；檢測(cè)技術(shù)

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)又稱(chēng)非洲豬瘟疫，是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的一種嚴(yán)重危害豬及野豬的動(dòng)物傳染病，其病程短，死亡率高達(dá)100 %。該病屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)要求報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國(guó)動(dòng)物病原微生物名錄中列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1-3]。我國(guó)目前尚未有發(fā)生本病的報(bào)道，但由于我國(guó)是以農(nóng)業(yè)為主的養(yǎng)豬大國(guó)，國(guó)際貿(mào)易往來(lái)頻繁，存在輸入性風(fēng)險(xiǎn)。因此，掌握ASF診斷方法，對(duì)防止ASF的傳入具有重要意義。

1　非洲豬瘟的診斷

非洲豬瘟綜合癥狀復(fù)雜，在臨床上難以和豬瘟區(qū)別診斷。豬感染ASFV后雖可產(chǎn)生特異性抗體，但這些抗體沒(méi)有中和作用，也缺乏有效的保護(hù)性。耐過(guò)豬對(duì)同型毒株的有抵抗力，但對(duì)異源毒株極為敏感，至今仍沒(méi)有可預(yù)防的疫苗。抗凝血液、脾和淋巴結(jié)等是用于診斷非洲豬瘟的常用材料。送檢樣本時(shí)應(yīng)盡量冷藏或浸于甘油鹽水中。根據(jù)流行病學(xué)、臨診癥狀和病理剖解可對(duì)ASF做初步診斷，確診可通過(guò)病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)[4,5]。

1.1 非洲豬瘟的臨床癥狀

豬感染ASFV后的潛伏期一般為5 d～15 d，根據(jù)感染毒株毒力的不同，臨床癥狀可分為最急性、急性、亞急性和慢性四種類(lèi)型。最急性型由強(qiáng)毒株感染引起，常無(wú)臨床癥狀突然死亡，死亡率高達(dá)100 %。急性型病豬體溫40.5 ℃～42 ℃，以高熱、出血和高死亡率為特征，精神沉郁，食欲減退，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，局部皮膚發(fā)紅或發(fā)藍(lán)、可視黏膜潮紅、眼有分泌物、嘔吐、腹瀉、咳嗽、呼吸困難和懷孕母豬流產(chǎn)等癥狀，死亡率可達(dá)100 %。亞急性型由中等毒力毒株感染引起，癥狀較輕，病死率較低，間斷性發(fā)熱持續(xù)1個(gè)月之久，呼吸窘迫、關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，懷孕母豬常常流產(chǎn)。慢性型由低毒力毒株感染引起，除波狀熱、生長(zhǎng)減慢、發(fā)育遲緩或瘦弱外，不表現(xiàn)明顯的癥狀。

1.2 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1 非洲豬瘟的病原學(xué)檢測(cè)

非洲豬瘟病原學(xué)診斷主要包括病毒分離、熒光抗體試驗(yàn)(FAT)、雙抗體夾心ELISA等診斷技術(shù)。

病毒分離：非洲豬瘟病毒的分離要在具有三級(jí)生物安全(BSL-3)以上的生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，分離樣本可以是豬血液及器官組織，包括脾臟、肝臟、肺臟及心臟。豬外周血單核細(xì)胞是常用的初次分離病毒的細(xì)胞，感染ASFV時(shí)，單層豬外周血單核細(xì)胞具有血細(xì)胞吸附特性及細(xì)胞死亡，以此來(lái)指示分離的病毒呈陽(yáng)性。

熒光抗體試驗(yàn)(FAT)：非洲豬瘟抗原能夠與標(biāo)記有熒光素的抗ASFV特異性抗體相結(jié)合，用于野外可疑豬或?qū)嶒?yàn)室接種豬病變組織的ASFV抗原檢測(cè)，也可以用于鑒定無(wú)紅細(xì)胞吸附能力的毒株及區(qū)分非洲豬瘟病毒和偽狂犬病毒在細(xì)胞上形成的細(xì)胞病變。雖然該方法檢測(cè)快速、敏感性和特異性都高，但是由于實(shí)驗(yàn)需要昂貴的熒光顯微鏡和高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體，再加上熒光素標(biāo)記技術(shù)要求高，需要專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)員，目前該方法僅作為診斷ASFV的輔助檢測(cè)方法。

雙抗體夾心ELISA：特異性單克隆抗體包被酶標(biāo)板，加入待檢樣本后，如果樣本中含有目的抗原，則抗原與單抗特異性結(jié)合，再加入抗原另一表位的酶標(biāo)單抗，形成類(lèi)似雙抗體夾心復(fù)合物，加入底物顯色后指示抗原的存在。Vidal等以抗非洲豬瘟病毒抗原性結(jié)構(gòu)蛋白VP73蛋白的特異單克隆抗體為基礎(chǔ)建立了夾心ELISA方法。INGENASA夾心ELISA試劑盒，以包被的P72(又稱(chēng)P73)單抗檢測(cè)樣本中的病毒抗原，可以檢測(cè)血液及多種組織中的病毒抗原，特異性、敏感性均很好，是OIE指定的ASFV檢測(cè)試劑盒。算，從而評(píng)價(jià)陽(yáng)性樣本抗體含量及結(jié)合力，與間接ELISA或夾心ELISA結(jié)果相反，顯色反應(yīng)后陽(yáng)性樣本檢測(cè)孔呈色淺，OD值低。該方法的出現(xiàn)為非洲豬瘟的診斷提供了一種無(wú)感染性的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，特別是對(duì)于還沒(méi)有發(fā)生非洲豬瘟疫情的國(guó)家來(lái)講更具有現(xiàn)實(shí)意義，INGENASA阻斷ELISA試劑盒，以VP73病毒蛋白為包被抗原檢測(cè)非洲豬瘟特異抗體，為OIE指定參考的非洲豬瘟診斷試劑盒。

1.2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

1.2.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

血清學(xué)檢測(cè)方法有間接免疫熒光試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA或阻斷ELISA等。

免疫熒光試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是敏感性高和快速，但難以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的大批量檢測(cè)，且自動(dòng)化程度不高。FAT的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、特異，靈敏。但是熒光素存在非特異性染色的弊端，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。所以FAT被OIE列為檢測(cè)ASF的輔助方法。

血凝試驗(yàn)具備的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以有效地降低假陽(yáng)性率，可靠性強(qiáng)。缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)，不易操作，對(duì)紅細(xì)胞的新鮮度有要求，實(shí)驗(yàn)效果也受到細(xì)胞形態(tài)的直接影響，而且非血球吸附的毒株會(huì)導(dǎo)致假陰性，有一定的局限性，故該方法很難在ASF感染的早期做出檢測(cè)，只能作為輔助檢測(cè)。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA或阻斷ELISA：利用待檢血清樣本與特異酶標(biāo)單抗同時(shí)或先后與包被抗原結(jié)合反應(yīng)，如果待檢血清當(dāng)中含有針對(duì)抗原的特異性抗體，將會(huì)抑制包被抗原與單抗的結(jié)合，樣本抑制率根據(jù)陰陽(yáng)性樣本的OD值計(jì)

核酸檢測(cè)：基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的核酸檢測(cè)技術(shù)，具有易操作、敏感性高、特異性強(qiáng)、對(duì)樣本要求不高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷，是非疫區(qū)檢測(cè)疫病的重要手段之一。根據(jù)ASFV基因組中含有的高度保守基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增達(dá)到ASFV核酸的檢測(cè)目的。PCR技術(shù)不僅快速、靈敏，而且對(duì)檢測(cè)樣本來(lái)源要求較低，組織、血液、分泌物等都可以作為ASFV DNA的檢測(cè)樣本，能從出現(xiàn)臨床癥狀前病豬采集的樣本中檢測(cè)病毒DNA，實(shí)現(xiàn)早期診斷。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，熒光定量PCR、多重PCR技術(shù)以及新興的環(huán)介導(dǎo)恒等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)等方法較普通PCR技術(shù)在ASFV核酸檢測(cè)方面顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)，并日益得到廣泛的應(yīng)用。

目前，成熟的PCR檢測(cè)方法主要選取ASFV的P72基因作為目的基因，根據(jù)不同毒株P(guān)72基因的高度保守序列設(shè)計(jì)出引物，抽提樣本中病毒的DNA作為模板，建立的PCR方法能夠有效地檢測(cè)出脾臟等組織中的病毒。John McKillen等建立的PCR方法，可以鑒別診斷出ASF和古典豬瘟[6]。在此基礎(chǔ)上，Mckillen還建立了Real-time PCR，與普通PCR相比，其靈敏度和特異性更強(qiáng)，對(duì)樣本中的核酸可以做到實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，同時(shí)可有效降低電泳過(guò)程中瓊脂糖凝膠對(duì)PCR結(jié)果的影響，結(jié)果更加直觀。國(guó)內(nèi)的蔣正軍、孫懷昌等也建立了Taq Man探針，取得了良好的效果。但該方法的缺點(diǎn)是定量PCR儀價(jià)格昂貴，成本較高，對(duì)試驗(yàn)耗材要求高，偶爾會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。

Bastos等通過(guò)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物，建立了巢式PCR，再次從普通PCR檢出結(jié)果為陰性的60份樣本中，檢測(cè)出近20份陽(yáng)性[7]。該方法也可用于檢測(cè)軟蜱體內(nèi)的ASFV，靈敏度良好。在靈敏度方面，相比于傳統(tǒng)的病毒分離法和OIE的PCR方法，Bastos等建立的巢式PCR更有優(yōu)勢(shì)。江彥增等建立了ASFV的等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增法，在爆發(fā)疫情的野外和不具備試驗(yàn)條件的地區(qū)，該方法亦可對(duì)ASFV進(jìn)行檢測(cè)[8]。

2 小結(jié)

隨著非洲豬瘟在我國(guó)周邊國(guó)家和地區(qū)的發(fā)生與流行，提示我們必須加強(qiáng)對(duì)非洲豬瘟的防控工作，對(duì)非洲豬瘟的診斷技術(shù)要不斷研究，盡快開(kāi)發(fā)出可鑒別非洲豬瘟的快速、特異且敏感的診斷方法，這些對(duì)預(yù)防和控制非洲豬瘟在我國(guó)的流行具有十分重要的意義。□□

參考文獻(xiàn)：(10篇，略)

中圖分類(lèi)號(hào)：S828.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-0769(2016)01-0048-02