賈文青 綜述 劉　瑩 審校

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科　450052)

·綜述·

結核感染T細胞斑點試驗對結核病診斷的研究進展

賈文青 綜述 劉瑩△審校

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科450052)

關鍵詞:結核??；結核感染T細胞斑點試驗；結核菌素試驗；診斷價值

近年來全球結核病疫情呈明顯上升趨勢，據WHO估計全球有1/3的人口感染結核分枝桿菌，每年約800萬新發(fā)結核病患者，200萬人死于結核病[1]。我國是全球結核病高負擔國家之一，2010年全國第5次結核病流行病學調查顯示，我國現有活動性結核患者523 萬,占全球發(fā)病的14.3%[2]。早期確診可以有效控制結核，具有積極的臨床意義。傳統檢測方法：(1)結核分枝桿菌培養(yǎng)法。結核分枝桿菌培養(yǎng)法特異性高,而染色陽性率低，培養(yǎng)需4～8周，可延誤診斷，影響治療。(2)痰涂片法。痰涂片法操作簡單，但陽性率僅為30%～60%,因此不利于臨床結核病的診斷和治療[3]。(3)組織病理學檢查。組織病理學檢查是有創(chuàng)性操作，患者依從性差，花費高。(4)結核菌素皮膚試驗(TST)。TST長期應用于結核感染的篩查，存在許多缺陷，因其使用的結核菌素純蛋白衍生物(PPD)易與非MTB及卡介苗(BCG)發(fā)生交叉反應，導致其特異度及敏感度較低。Diel 等[4]的Meta分析報道顯示，TST敏感度僅為67%～72%。此外TST需要72 h后出結果，時間長，患者依從性差，且結果判讀主觀性較強，從而影響結果的準確性。(5)結核血清學檢測。結核血清學檢測操作簡單，用時較少，但存在假陽性和假陰性的問題。如果患者存在免疫功能低下或者是處于疾病早期，機體不能產生足夠的抗體，就會出假陰性，接種過卡介苗，體內存在一定水平的抗體，可能會出現假陽性。近年來,γ-干擾素釋放試驗(IGRA)逐漸受到重視,目前全球有16個國家陸續(xù)將其列入結核病臨床應用指南，以協助診斷結核[5]。IGRA在我國仍然處于研究階段，國內常用的方法有IGRA-ELISA和結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)。國內很多研究證實，T-SPOT．TB可以幫助診斷結核病，目前已廣泛應用于臨床。本文將近幾年T-SPOT.TB對結核病診斷的臨床應用價值進展情況進行分析，綜述如下。

1T-SPOT.TB簡介

T-SPOT.TB是由酶聯免疫斑點法(ELISPOT)發(fā)展而來的新型免疫酶技術，ELISPOT源于1996年發(fā)現一段存在結核分枝桿菌中名為 “結核分枝桿菌差異區(qū)1(RD1)”的基因序列。相對分子質量為6×103的早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和相對分子質量為10×103的培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)是結核分枝桿菌RD1區(qū)編碼的相應抗原，該區(qū)只存在于結核分枝桿菌復合群和少數致病性分枝桿菌基因組中，所有卡介苗菌株及大多數非致病性分枝桿菌基因組中均缺乏該區(qū)域。當機體感染結核分枝桿菌后，體內就會發(fā)生細胞免疫，產生特異的效應T淋巴細胞，其在體外再次受結核菌特異抗原的刺激時會分泌γ-干擾素(IFN-γ)，通過計數分泌IFN-γ的外周血單個核細胞，可以了解機體是否感染結核分枝桿菌。ESAT-6和CFP-10作為特異性抗原刺激機體特異性T細胞產生IFN-γ，T-SPOT.TB就是利用ELISPOT檢測分泌IFN-γ的T細胞斑點數的技術，1個斑點代表1個效應T細胞。目前它是檢測抗原特異性T細胞最敏感的方法之一,可以檢測出1/100 000～1/50 000外周血單個核細胞中特異性抗原刺激后釋放IFN-γ的效應T細胞，從而幫助診斷結核。

2T-SPOT.TB臨床應用進展

2.1T-SPOT.TB對肺結核診斷價值結核病嚴重危害我國居民的健康，目前結核病的確診主要依靠涂片、培養(yǎng)找到結核分枝桿菌，但是肺結核患者痰涂片陽性率低，培養(yǎng)所用周期長，影響早期診斷。肺外結核病變部位取材往往比較困難，依據病原學確診比較困難。菌陰性肺結核及肺外結核患者的快速診斷對臨床工作者來說是一項巨大挑戰(zhàn)。近幾年新興起來的T-SPOT.TB技術所采用的特異性抗原(ESAT-6與CFP-10)不存在于卡介苗及絕大多數環(huán)境分枝桿菌中，保證了較高的特異性。我國屬于卡介苗廣泛接種地區(qū)，這就使其在我國具有了獨特的診斷結核的價值。因此評價T-SPOT.TB對肺結核尤其是菌陰肺結核及肺外結核的診斷價值是非常有意義的。Pan等[6]報道 T-SPOT.TB診斷肺結核的陽性率為91.3%，孫雯雯等[7]研究認為，T-SPOT.TB檢測技術診斷肺外結核的敏感度在80.0%以上、特異性在60.0%以上。其數據差異可能與不同結核感染部位刺激人體產生IFN-γ的效應T細胞水平不同有關，但不管是肺結核還是肺外結核，T-SPOT.TB技術都具有較高的敏感度和特異性，可以為臨床診斷結核提供依據，是一種重要的免疫學檢查方法[8-9]。符艷等[10]進一步研究發(fā)現，T-SPOT.TB對診斷活動性結核的陰性預測值很高,而陽性預測值較低，這就提示,當T-SPOT.TB值為陰性時，考慮排除結核診斷的可能性大，尤其在免疫功能正常及臨床上無結核感染癥狀的人群，但還是存在一定的假陰性率。目前有研究認為,導致T-SPOT.TB假陰性的危險因素有高齡、體質量超標、入院前較長病程[6]、接受類固醇治療[11]、結核性腦膜炎[12]等。當患者有上述危險因素時，要考慮是否會存在假陰性的可能。當T-SPOT.TB結果為陽性時就需要結合患者臨床特征來判斷解讀其意義，如果患者有過結核感染病史，而目前沒有結核感染癥狀，不能認為患者處于活動性結核的狀態(tài)。由此可見，雖然T-SPOT.TB具有較高的敏感度及特異性，但是仍然需要臨床醫(yī)生對其結果作出慎重的判讀。

石慧等[13]國內學者對結核患者的胸腔積液和外周血分別進行了T-SPOT.TB檢測，發(fā)現其對胸腔積液檢測的敏感度和特異性高于外周血。出現這種結果可能是由于結核感染部位存在較多的效應T細胞，從而導致外周血效應T細胞減少。由此提示，臨床工作中必要時可對其感染灶部位的標本，如胸腔積液、腹水、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液進行T-SPOT.TB檢測。另外T-SPOT.TB24 h內出結果，可以早診斷，早治療，具有良好的應用前景。T-SPOT.TB有望成為繼金標準之外很有效的輔助診斷結核的方法。

2.2T-SPOT.TB對免疫抑制患者合并結核的診斷當機體受到結核分枝桿菌感染時會啟動細胞免疫過程，T細胞在結核病的臨床免疫過程中扮演著重要角色。因此免疫力低下特別是細胞免疫力低下的患者T細胞功能下降、數量減少，勢必會增加機體結核易感率。如糖皮質激素因其強大的抗炎、抗過敏作用廣泛應用于臨床，但同時又有免疫抑制的作用，可誘導T細胞凋亡，抑制抗體生成,此時若受到結核分枝桿菌入侵，易感染而發(fā)病。另外高血糖、腫瘤患者生存期延長、HIV感染等往往也會造成患者免疫功能下降，易導致結核感染，這類患者合并結核感染時其結核中毒癥狀不明顯，有時往往易被原發(fā)病掩蓋，容易誤診，危及患者生命。傳統TST由于患者免疫應答被抑制，結核菌素反應減弱，在免疫力低下患者中陽性率僅為16.7%[14]。Chen等[15]報道T-SPOT.TB診斷免疫功能低下患者合并結核感染的敏感度為77.4%，特異性為63.1%，可見在免疫功能低下的患者中T-SPOT.TB仍然有較高的敏感度，與TST相比，T-SPOT.TB具有較大的優(yōu)勢。HIV感染/艾滋病(AIDS)患者的細胞免疫功能受到破壞，T細胞尤其是CD4+T細胞明顯減少，國際上衡量HIV感染患者免疫狀態(tài)的金標準為CD4+T細胞計數。關于該類患者的免疫狀態(tài)是否會影響T-SPOT.TB的結果目前爭議比較大，付津平等[16]對20例確診HIV感染/AIDS合并結核感染的患者進行研究發(fā)現，CD4+T細胞的減少不影響T-SPOT.TB結果，T-SPOT.TB不受免疫狀態(tài)的影響，這主要是因為T-SPOT.TB分離定量的外周血淋巴細胞在一定程度上可避免免疫狀態(tài)的影響。也有研究認為，HIV感染/AIDS患者細胞免疫功能受到嚴重損害，影響T-SPOT.TB的敏感度，導致T-SPOT．TB結果易出現假陰性[17]。出現這種結果的原因可能是因為HIV感染/AIDS患者細胞免疫功能低下，抗原刺激不足以引起有效的免疫應答，ESAT-6和CFP-10的反應受到影響，導致了T-SPOT.TB的敏感度降低。目前尚無大規(guī)模的研究探討T-SPOT.TB是否受人體免疫狀態(tài)的影響，這是臨床上需要深入研究的問題。

2.3T-SPOT.TB對潛伏性和活動性結核的鑒別診斷目前我國潛伏性結核感染人群數量巨大，新增活動性結核患者每年約145萬人，控制活動性結核患者必須從控制潛伏性結核感染做起。T細胞斑點數在一定程度上可反映體內結核分枝桿菌的負荷，結核分枝桿菌負荷越高，刺激機體產生IFN-γ的效應T細胞越多，產生斑點數越多，越傾向于活動性結核。鑒于T-SPOT.TB檢測的斑點形成細胞數與結核活動程度存在一定的正相關趨勢，可以期望找到T-SPOT.TB的一個界值來區(qū)分活動性結核和潛伏性結核感染。Latorre等[18]認為，以T細胞斑點數作為鑒別活動性結核與潛伏性結核感染的最佳界值為50。但 Chee等[19]的研究表明，T-SPOT.TB可以幫助診斷結核分枝桿菌感染，然而對是否可以區(qū)分活動性還是潛伏性結核感染意義不是很大，這主要是因為T細胞斑點數在這兩類結核感染中有較大范圍重疊。引起這種現象的原因可能是因為對潛伏性結核感染者來說其免疫功能較好，較少的抗原刺激就激發(fā)出活躍的保護性免疫，其T-SPOT.TB值高，而對活動性結核患者來說其免疫功能低下，大量的抗原刺激也不足以激起有效的細胞免疫，其T-SPOT.TB值就會降低。是否可以將T-SPOT.TB檢測技術應用于潛伏性和活動性結核的鑒別仍然需要臨床采集大量標本進行研究。

2.4T-SPOT.TB對結核治療效果監(jiān)測的價值當結核患者接受抗結核藥物治療時，臨床醫(yī)生目前主要依靠患者臨床癥狀及影像學檢查來評估療效，但是這兩種方法主觀性太強。最近研究表明，T-SPOT．TB有望成為抗結核療效觀察的客觀指標。T-SPOT.TB反應性主要受抗原載量、宿主免疫狀態(tài)的影響，但具體哪個因素對T-SPOT.TB結果影響較大，目前還少有研究。直觀來看，不考慮患者免疫因素是當結核患者接受抗結核藥物治療時，由于效應T細胞存活期比較短，一般在結核桿菌被消滅后可迅速減少，T-SPOT.TB反應性也會隨之降低，因而斑點數結果可出現下降甚至陰性的結果，因此T-SPOT.TB可定量監(jiān)測抗結核治療效果。Wilkinson等[20]對結核病患者進行了研究，發(fā)現在抗結核治療1年后T-SPOT.TB斑點數明顯下降，55%的患者甚至轉為陰性。但是，一些胞內結核抗原可能會在機體循環(huán)中釋放出來，很難確定抗結核治療是否會減少T-SPOT.TB斑點數值。普遍認為，T-SPOT.TB斑點數值代表分泌IFN-γ的效應T細胞數量，斑點數反映了機體是否受過結核分枝桿菌的感染，與機體的細胞免疫功能直接相關。T-SPOT.TB的斑點數與效應T細胞呈對應關系，即1個斑點數可以代表1個效應T細胞，但結核桿菌與效應T細胞即斑點數之間是否有對應關系，對于這其中的機制研究并不是很清楚。在這種機制不是很清楚的情況下，如果認為T-SPOT.TB可以監(jiān)測抗結核治療預后是有些草率。而且國外有研究發(fā)現，活動性結核患者往往合并有免疫功能低下，當行抗結核治療一段時間后免疫功能較前恢復，此時結核效應T細胞增多，導致T-SPOT.TB結果增高[21]。Adetifa等[22]研究發(fā)現，對未接受治療的潛伏結核感染者在不同時間進行T-SPOT.TB，發(fā)現斑點數有自然下降的規(guī)律。因此，目前雖然沒有足夠的證據表明T-SPOT.TB可以作為一種結核治療的監(jiān)測方法，但可以認為T-SPOT.TB對結核治療效果評價及患者的預后還是有一定的提示意義。未來T-SPOT.TB動態(tài)檢測是否可用于評價患者對抗結核治療的反映，還需要更大規(guī)模、更全面的臨床研究加以闡明。

3結語

和傳統的TST比較，T-SPOT.TB不受機體免疫狀態(tài)、卡介苗接種的影響，T-SPOT.TB是從單細胞水平進行檢測，可及時捕獲細胞分泌于表面的細胞因子，在檢測結核分歧桿菌感染方面具有較高的敏感度和特異性，能夠在短時間內幫助快速診斷結核病，在預防、控制和輔助診斷結核病方面具有重要意義。T-SPOT.TB優(yōu)勢在于直接檢測人體細胞因子分泌細胞，具有較高的敏感度和特異性。T-SPOT．TB有助于肺內、肺外結核的診斷，在不同結核中診斷價值不同，但總的來說T-SPOT.TB對于結核的診斷有很好的輔助價值。雖然目前根據T-SPOT．TB結果還不能完全判定是潛伏性還是活動性結核感染，但通過斑點數可以提供鑒別依據。T-SPOT.TB目前在臨床上已經逐步開始廣泛應用，但也存在一定的假陽性與假陰性，臨床醫(yī)生可以將其作為一個參考指導下一步診斷及治療，但是不能盲目依賴其結果，需要結合患者的具體臨床情況綜合作出判斷。此外T-SPOT．TB價格昂貴，操作復雜，限制了它在經濟落后地區(qū)的使用。

綜上所述，T-SPOT.TB是診斷結核的一種具有廣泛應用前景的免疫學方法，但仍然需要更多大規(guī)模、針對不同人群的研究來驗證。今后需要對T-SPOT．TB的臨床應用價值進行更科學準確的評價，從而得出T-SPOT．TB對結核病診斷最有效的應用原則，更好地利用T-SPOT．TB輔助結核的診斷。

參考文獻

[1]Stein CM,Baker AR.Tuberculosis as a complex trait:impact of genetic epidemiological study design[J].Mamm Genome,2011,22(1/2):91-99.

[2]全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組,全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志，2012，34(8)：485-580.

[3]Druszczynska M,Kowalewicz-Kulbat M,Fol M,et al.Latent M.tuberculosis infection-pathogenesis,diagnosis,treatment and prevention strategies[J].Pol J Microbiol,2012,61(1):3-10.

[4]Diel R,Loddenkemper R,Nienhaus A.Evidence-based comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active TB:a meta-analysis [J].Chest,2010,137(4):952-968.

[5]尹青琴,申阿東.不同國家γ干擾素釋放試驗臨床應用指南的概述[J].國際呼吸雜志,2011,31(21):1663-1666.

[6]Pan L,Jia H,Liu F,et al.Risk factors for false-negative T-SPOT.TB assay results in patients with pulmonary and extra-pulmonary TB[J].J Infect,2015,70(4):367-380.

[7]孫雯雯,肖和平,吳福蓉,等.結核感染T細胞斑點試驗在臨床診斷為肺外結核患者中的價值評價[J].中國防癆雜志,2015,37(7):784-789.

[8]Fan L,Chen Z,Hao XH,et al.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis:a systematic review and meta-analysis[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2012,65(3):456-466.

[9]Zhong L,Zhou XL,Li J,et al.The T-SPOT.TB Test for Diagnosis of Breast Tuberculosis[J].Lab Med,2015,46(1):14-19.

[10]符艷,蔣正華.結核免疫斑點試驗與結核菌素試驗在活動性結核病診斷中的優(yōu)越性對比[J].中國醫(yī)刊,2015,44(8):54-57.

[11]Liao CH,Lai CC,Tan CK,et al.False-negative results by enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma among patients with culture-confirmed tuberculosis[J].J Infect,2009,59(6)：421-423.

[12]Lee YM,Park KH,Kim SM,et al.Risk factors for false-negative results of T-SPOT.TB and tuberculin skin test in extrapulmonary tuberculosis[J].Infection,2013,41(6):1089-1095.

[13]石慧,崔麗英.結核感染T細胞斑點試驗診斷結核性胸膜炎的應用價值[J/CD].中華肺部疾病雜志(電子版),2015,8(2):51-54.

[14]萬榮,汪亞玲,祈燕偉,等.結核感染T細胞斑點試驗在HIV/AIDS合并結核感染診斷中的應用[J].昆明醫(yī)學院學報,2011,32(7):138-141.

[15]Chen J,Zhang R,Wang J,et al.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of active tuberculosis in HIV-infected patients:a systematic review and meta-analysis[J].PLoS One,2011,6(11):e26827.

[16]付津平,可春梅.T細胞酶聯免疫斑點試驗與結核抗體平行檢測HIV感染/AIDS合并結核感染比較[C].//中華醫(yī)學會,中國性病艾滋病防治協會.第四屆全國艾滋病臨床影像學術會議暨第二屆全國感染及傳染影像學最新進展學術會議論文集.鄭州，2011.

[17]Karam F,Mbow F,Fletcher H,et al.Sensitivity of IFN-gamma release assay to detect latent tuberculosis infection is retained in HIV-infected patients but dependent on HIV/AIDS progression[J].PLoS One,2008,3(1):e1441.

[18]Latorre I,De Souza-Galvao M,Ruiz-Manzano J,et al.Quantitative evaluation of T-cell response after specific antigen stimulation in active and latent tuberculosis infection in adults and children [J].Diagn Microbiol Infect Dis,2009,65(3):236-246.

[19]Chee CB,KhinMar KW,Gan SH,et al.Tuberculosis treatment effect on T-cell interferon-gamma responses to Mycobacterium tuberculosis-specific antigens[J].Eur Respir J,2010,36(2):355-361.

[20]Wilkinson KA,Kon OM,Newton SM,et al.Effect of treatment of latent tuberculosis infection on the T cell response to Mycobacterium tuberculosis antigens[J].J Infect Dis,2006,193(3):354-359.

[21]Ferrand RA,Bothamley GH,Whelan A,et al.Interferon-gamma responses to ESAT-6 in tuberculosis patients early into and after anti-tuberculosis treatment [J].Int J Tuberc Lung Dis,2005,9(9):1034-1039．

[22]Adetifa IM,Ota MO,Jeffries DJ,et al.Interferon-gamma ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection:a clinical trial[J].Am J Respir Crit Care Med,2013,187(4):439-445．

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.028

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1519-04

(收稿日期：2016-01-20修回日期：2016-02-27)

△通訊作者，E-mail:Liuying03341237@126.com。