邢志芳,曹國君，趙 縝，趙紅英，潘惠芬，夏建紅

(1.復旦大學附屬閔行醫(yī)院輸血科,上海 201199；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學科,上海 200040；3.復旦大學附屬閔行醫(yī)院檢驗科,上海 201199；4.濰坊醫(yī)學院,山東濰坊 261053)

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·論 著·

煙曲霉熒光探針實時PCR法的臨床應用價值研究*

邢志芳1,曹國君2△，趙 縝3，趙紅英4，潘惠芬3，夏建紅3

(1.復旦大學附屬閔行醫(yī)院輸血科,上海 201199；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學科,上海 200040；3.復旦大學附屬閔行醫(yī)院檢驗科,上海 201199；4.濰坊醫(yī)學院,山東濰坊 261053)

目的 建立一種針對煙曲霉的探針實時聚合酶鏈反應(PCR)法并初步探討其臨床應用價值。方法 以煙曲霉基因組內(nèi)特有序列為靶位，設計引物、探針，建立PCR反應體系，初步應用于臨床痰標本和血漿標本的檢測驗證其檢測性能。結果 所建針對煙曲霉的實時PCR法具有良好的靈敏度和特異度，將其應用于臨床痰標本和血漿標本的檢測效果較好。結論 所建立的熒光探針實時PCR法初步應用于臨床痰標本和血漿標本檢測，效果良好，其實際臨床應用價值仍需進行大樣本驗證。

煙曲霉菌； 探針實時聚合酶鏈反應法； 臨床應用

近年來，侵襲性真菌病(IFD)的致死率仍居高不下，IFD的早發(fā)現(xiàn)、早治療仍是當前改善患者預后的最佳途徑。而由于IFD缺乏特異性的臨床癥狀和體征，傳統(tǒng)的實驗室方法在靈敏度和特異度等方面存在缺陷，導致IFD的臨床診斷率和實驗室診斷率偏低[1]。近年來，隨著分子生物學的高速發(fā)展，使人們將IFD的早檢測、早發(fā)現(xiàn)寄希望于分子生物學手段，雖然此方法尚不成熟，但具有重要的潛在應用價值[2-3]。本課題組在前期工作中建立了SYBR染料法實時聚合酶鏈反應(PCR)檢測體系，但由于此方法的原理是利用熒光染料結合到DNA上發(fā)光而實現(xiàn)定量，當反應體系內(nèi)發(fā)生非特異性擴增時難以辨別，即與探針法實時PCR檢測體系相比，此方法在特異性方面存在缺陷，制約了將來其在臨床的推廣應用。為此，本課題組在前期工作的基礎上設計探針，優(yōu)化反應條件，建立了探針法實時PCR檢測體系，并將其應用于臨床標本的檢測，取得了良好的效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取前期實驗中的160例免疫低下患者的194例痰標本作為研究對象[4]，同時選取瑞金醫(yī)院40例已明確臨床IFD診斷的骨髓移植患者的112例血漿標本進行驗證。

1.2 材料、儀器與試劑 同前期實驗[5]。

1.3 真菌基因組DNA提取 具體方法同前期實驗[6]。

1.3.1 煙曲霉實時PCR檢測方法(探針法)的建立 在前期實驗所建立的SYBBR染料法實時PCR檢測體系的基礎之上[5]，原引物和反應體系不變，設計合成新探針，具體序列為5′FAM-GCA AGG CGA TTT ATC TCA CCA CT-3′TARMA，PCR擴增條件為：50 ℃，2 min；94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火延伸45 s，共40個循環(huán)。構建含靶片段的PMD19-T質(zhì)粒重組體，制備梯度濃度的標本，驗證該方法的檢測靈敏度，同時驗證其特異性，具體操作同前。

1.3.2 煙曲霉實時PCR用于臨床標本的檢測 以所建立的煙曲霉實時PCR法檢測194例來自臨床的痰標本和112例血漿標本DNA,并初步驗證其臨床應用價值，并將其結果與之前通用PCR法結果(擴增產(chǎn)物測序分析)進行比較，同時將煙曲霉探針法實時PCR法檢測陽性的標本送生工生物工程(上海)有限公司測序驗證；為排除由抑制物引起的假陰性情況，對所有的標本均進行人GAPDH基因檢測。

2 結 果

2.1 煙曲霉實時PCR法的檢測性能 PCR擴增曲線良好，標準曲線的斜率為-3.293 921，截距為46.210 117，相關系數(shù)為0.994 966，提示相關性良好，可以滿足實驗的基本要求；線性檢測范圍的上限為108copy/mL,下限為102copy/mL，提示檢測靈敏度較高；以非煙曲霉基因組DNA進行擴增時，未見非特異性擴增，表明該擴增體系的特異性較好。

2.2 煙曲霉實時PCR法的臨床應用效果 在194例臨床痰標本DNA中包含176例念珠菌陽性標本，2例煙曲霉陽性標本，16例陰性標本，經(jīng)該煙曲霉探針法實時PCR法檢測，2例陽性標本均被檢出，其他192例標本均未出現(xiàn)擴增，該結果與原實驗通用PCR法結果一致，符合預期，且提示此實驗中該方法的檢測靈敏度和特異度均為100%；骨髓移植患者的112例臨床標本中，包含2例煙曲霉菌，用所建立的煙曲霉探針法實時PCR法進行檢測時，均可以檢出，而其他110例標本則未出現(xiàn)擴增，同樣說明所建立的新方法具有良好的檢測性能。將煙曲霉陽性標本的PCR產(chǎn)物送測序，測序分析結果與PCR結果一致。以上兩類標本，均對其進行了人GAPDH基因檢測，擴增曲線良好，均提示標本中無明顯的擴增反應抑制劑存在。

3 討 論

真菌多為條件致病菌，對免疫力正常的人群一般不會致病，然而當機體處于免疫妥協(xié)狀態(tài)時，可能會導致IFD的發(fā)生[7]。以往的臨床研究大多僅重點關注移植患者的IFD情況，而非移植群體的情況相關報道少見[8]。近年來，IFD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且其致病菌種的流行病學也在不斷變化[9]。由于IFD無特異性的臨床癥狀和體征，且容易被基礎疾病或免疫抑制所掩蓋，因此其確診主要依靠實驗室檢查，傳統(tǒng)實驗室真菌檢測方法因在靈敏度和特異度等方面存在缺陷，IFD的實驗室檢查漏診率高，不能滿足當前臨床需求，由于侵襲性真菌病發(fā)病兇險、確診困難、病原體耐藥、病情進展快、預后不佳、治療不良反應較多及費用高等特點，其診斷和治療一直是困擾臨床工作的難點之一[10-11]。早期診斷、及時治療是改善預后的關鍵，意義重大[12]。雖然近年來IFD診斷技術不斷進步和新型抗真菌藥物不斷面世，但IFD發(fā)病率仍呈上升趨勢。

傳統(tǒng)檢測方法如真菌培養(yǎng)鑒定、鏡檢、G實驗和GM實驗等均不夠理想，組織病理學檢查雖為IFD診斷的金標準，但由于其存在一定的創(chuàng)傷性而不被大多數(shù)患者所接受。此外，組織病理學檢查靈敏度較低且獲取標本困難，對于有嚴重基礎疾病者往往不易進行等缺陷，制約了其在臨床的廣泛應用。充分利用現(xiàn)代先進的檢驗手段，加強病原學監(jiān)測，提高早期診斷率，近年來，隨著分子檢測水平的快速發(fā)展，國內(nèi)外大量學者將IFD的早期診斷寄希望于PCR法，并進行了一系列研究，目前已取得了較大進展，但仍存在許多問題，如方法學未標準化，缺少統(tǒng)一的標準，周圍環(huán)境中真菌無處不在，如何才能有效控制其對標本的污染等[13]。關于PCR技術在IFD早期檢測應用方面，有的學者認為該方法尚不成熟，尚需更多的研究加以完善；有的學者認為當前已經(jīng)開發(fā)了足夠的專有技術，當前可以考慮進行大規(guī)模臨床實驗。本課題組的研究表明多種檢測方法聯(lián)合應用，可以提高IFD的診斷率和陰性除外價值[14]，尤其是PCR法具有檢測靈敏度高的特點，其陰性除外價值更加有價值。本課題組在前期工作的基礎上建立了針對煙曲霉的實時PCR檢測方法(探針法)，本實驗過程中陰性對照標本與待測標本按1∶10的比例進行全程監(jiān)控，有效監(jiān)控因污染而導致假陽性結果的情況。與先前所建立的熒光染料法相比，探針法具有更高的特異度，有利于將來臨床的推廣應用。與通用PCR法相比，實時PCR法可以實現(xiàn)更加準確的定量，可為臨床區(qū)分真菌的感染和定植提供依據(jù)，為疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療初步奠定基礎，且實時PCR法擴增完成后結果分析過程中無需開蓋操作，大大降低了實驗室PCR擴增產(chǎn)物污染事件的發(fā)生率，該方法具有較好的臨床應用前景，其不足之處在于所建立的實時PCR法只能用于煙曲霉菌的檢測，且如果煙曲霉相關基因位點發(fā)生突變，煙曲霉菌將不能被檢出。目前臨床上確診IFD的方法對專業(yè)技術要求高，且結果的判斷帶有主觀性，耗時長，導致早期確診困難；與傳統(tǒng)的實驗室檢測方法相比，PCR法具有更高的檢測靈敏度，在IFD的早發(fā)現(xiàn)中具有明顯的優(yōu)勢，PCR法有助于早診斷、早治療，明顯改善疾病預后，且有效減少不必要的抗生素濫用。有研究認為，長期使用廣譜抗生素，可導致中性粒細胞釋放過氧化物減少，繼而其破壞真菌菌絲細胞壁的有效性大大降低，更容易導致IFD的發(fā)生[8]。此外，抗真菌藥物品種相對較少、不良反應大且價格昂貴，經(jīng)驗性用藥與精準醫(yī)療的潮流不符，且容易引起醫(yī)患矛盾，因此探索出一種快速準確的IFD早期檢測方法，為臨床的診斷和治療提供依據(jù)，具有重要的意義。分子生物學方法應用于IFD的檢測，有助于提高IFD診斷水平，應用前景良好[15]，但仍需進行大規(guī)模、多中心的臨床實驗進行驗證。

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Preliminary exploration on clinical application value of aspergillus fumigatus fluorescence probe real-time PCR method*

XINGZhifang1,CAOGuojun2△,ZHAOZhen3,ZHAOHongying4,PANHuifen3,XIAJianhong3

(1.DepartmentofBloodTransfusion,AffiliatedMinhangHospital,FudanUniversity,Shanghai201199,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedMinhangHospital,FudanUniversity,Shanghai201199,China;4.WeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261053,China)

Objective To establish a probe real-time polymerase chain reaction(PCR) method for aspergillus fumigatus and to preliminarily explore its clinical application value.Methods The special genome sequence of aspergillus fumigatus served as the target for designing corresponding primers and probe and establishing the PCR reaction system.This method was preliminarily applied in the detection of clinical sputum and plasma samples for verifying its detection performance.Results The established real time PCR method for aspergillus fumigatus had good sensitivity and specificity.The method showed good effect in detecting the clinical sputum and plasma samples.Conclusion The established fluorescence probe real-time PCR method for aspergillus fumigatus has good effect in preliminary application of clinical sputum and plasma sample detection.But its practical clinical value still needs to be verified by a larger sample.

aspergillus fumigatus; probe real-time PCR method; clinical use

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會青年項目(20154Y0141)；上海市閔行區(qū)科學技術委員會自然基金項目(2015MHZ003;2016MHZ01)；上海市閔行區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會基金項目(2014MW13)。

邢志芳，女，主管技師，主要從事臨床檢驗診斷研究?！?/p>

，E-mail:gjcao@foxmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.003

A

1673-4130(2016)24-3391-02

2016-09-10

2016-10-28)