吳建濤，王勤南，周 峰，謝 靜，許環(huán)映，常海龍(廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州5036；農(nóng)業(yè)部廣東甘蔗種質(zhì)資源與利用科學觀測實驗站，海南三亞5705)

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DNA指紋圖譜技術(shù)及其在甘蔗育種上的應用

吳建濤1,2，王勤南1,2，周 峰1,2，謝 靜1,2，許環(huán)映1,2，常海龍1,2
(1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2農(nóng)業(yè)部廣東甘蔗種質(zhì)資源與利用科學觀測實驗站，海南三亞572025)

摘 要：隨著分子標記的不斷開發(fā)和利用，DNA指紋圖譜技術(shù)得到了快速發(fā)展。本文簡要闡述了幾種常見的構(gòu)建DNA指紋圖譜分子標記方法的基本原理、優(yōu)缺點及其在構(gòu)建不同植物DNA指紋圖譜中的應用，總結(jié)了構(gòu)建指紋圖譜的指紋代碼的5種方法和在甘蔗育種中應用，并對DNA指紋圖譜在甘蔗育種應用中存在問題與展望進行了簡單的討論。

關鍵詞：DNA指紋圖譜；分子標記；甘蔗育種；應用

0 引言

DNA指紋圖譜技術(shù)(DNA Fingerprinting)是1984年由英國科學家Jeffreys開發(fā)出的。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新的分子標記不斷被開發(fā)和利用，建立在分子標記技術(shù)上的DNA指紋圖譜技術(shù)也得到了快速發(fā)展，利用分子標記構(gòu)建的DNA指紋圖譜可直接反映甘蔗的遺傳物質(zhì)在DNA分子水平上的差異，具有較高的多態(tài)性和個體特異性，且不受環(huán)境和生長階段影響，能鑒定形態(tài)標記所難以鑒定的個體[1]。近年來，DNA指紋圖譜技術(shù)廣泛應用于作物品種間的親緣關系分析和分子身份證繪制研究。

本文就構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標記類型、指紋代碼及在甘蔗育種中的應用作簡要綜述，以期為DNA指紋圖譜技術(shù)在甘蔗育種上的應用研究提供參考。

1 構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標記

DNA分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某些差異特征的DNA片段。目前，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，現(xiàn)在的DNA標記技術(shù)已有幾十種，主要有以下幾大類：第1類以Southern雜交為基礎，如限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、原位雜交(In Situ Hybridization, ISH)；第2類以PCR技術(shù)為基礎，如隨機擴增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、任意引物PCR(Arbitrary Primer-PCR, AP-PCR)、DNA指紋技術(shù)(DNA Fingerprinting, DAF)、擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、相關序列擴增多態(tài)性(Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP)、靶位區(qū)域擴增多態(tài)性(Target Region Amplified Polymorphism, TRAP)、插入/缺失多態(tài)性(Insertion/deletion Polymorphism, Indel或I/D)；第3類以重復序列為基礎，如簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、簡單序列重復間擴增多態(tài)性(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)；第4類以mRNA為基礎，如逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)、表達序列標簽(Expressed Sequence Tag, EST)；第5類以單核苷酸多態(tài)性為基礎，如單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)。

本文簡要介紹用于構(gòu)建DNA指紋圖譜的一些分子標記，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等。

1.1 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)

RFLP是以Southern雜交為基礎的第1代遺傳標記，1975年由美國科學家Grodzicker等[2]創(chuàng)立的，其基本原理是利用特定的限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進行酶切，利用凝膠電泳分析所形成的不同的DNA片段，經(jīng)轉(zhuǎn)膜和Southern雜交，分析DNA多態(tài)性。RFLP標記是共顯性標記，呈孟德爾遺傳，不受環(huán)境條件的影響；檢測可靠性高，重復性好。目前，RFLP標記已應用于家蠶[3]、細菌[4]等生物的指紋圖譜構(gòu)建。但是，RFLP的技術(shù)要求高，DNA需要量大，步驟較多，檢測時間長，成本高，需使用放射性同位素，難以大規(guī)模推廣應用。

1.2 隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)

RAPD是1990年由美國杜邦公司科學家Williams等[5]和加利福尼亞生物研究所Welsh等[6]發(fā)明的一種分子標記技術(shù)，它以基因組DNA為模板，以一個隨機多態(tài)核苷酸序列(8～10 bp)為引物，經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生不同的DNA片段，通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離檢測擴增DNA多態(tài)性。RAPD技術(shù)DNA用量少，顯性遺傳，簡單快速，引物設計隨機，不使用放射性同位素，可對未知序列的基因組進行多態(tài)性分析，進而構(gòu)建指紋圖譜。目前，RAPD已應用于茶樹[7]、鳶尾[8]等植物DNA指紋圖譜構(gòu)建。但是，RAPD技術(shù)穩(wěn)定性差、不同物種效果不同、不能鑒定雜合子、信息量較少。

1.3 擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)

AFLP是1993年由荷蘭科學家Zabeau等[9]發(fā)明的，其基本原理是用2種限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，然后再將特定的雙鏈接頭連接在酶切片段的兩側(cè)，形成帶接頭的特異性片段，以此為模板，以接頭序列和相鄰的限制性位點序列為基礎設計引物進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后檢測DNA多態(tài)性。AFLP結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，多態(tài)性豐富，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復性好，是典型的孟德爾遺傳，所需DNA量少，可以不知基因序列的情況下進行研究，在一次單個反應能檢測到大量的片段，可以分析基因組較大的作物，適合構(gòu)建復雜基因組植物的指紋圖譜。目前，己應用于水稻[10]、玉米[11]、棉花[12]等作物的指紋圖譜構(gòu)建。但是，AFLP是顯性標記，只顯示擴展片段的有或無，容易出現(xiàn)假陽性帶、技術(shù)復雜、成本高。

1.4 簡單重復序列(SSR)

SSR又稱微衛(wèi)星DNA(Microsatallite DNA)，是1982年由美國人Hamade等[13]創(chuàng)立的基于PCR的第2代分子標記。SSR是一種真核生物基因組中普遍存在的重復序列，一般由1～6個堿基組成，重復次數(shù)在不同物種或同一物種不同基因型之間是高度可變的，兩端是保守的單拷貝序列，可用于設計特異引物擴增中間的重復序列，通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析DNA多態(tài)性。SSR具有RFLP的優(yōu)點且不需要使用放射性同位素，同時比RAPD重復性和穩(wěn)定性高。SSR標記數(shù)量豐富，多態(tài)性高，呈共顯性，可鑒別雜合子和純合子，所需DNA量少，在構(gòu)建DNA指紋圖譜方面顯示了獨特的優(yōu)越性。國際植物新品種權(quán)保護聯(lián)盟(UPOV)在BMT分子測試指南中，已將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標記方法確定為SSR和SNP[14]，其中SSR標記因其技術(shù)比較成熟，成為當前各個作物建庫的首選標記。不同研究者利用SSR標記構(gòu)建了水稻[15]、玉米[16]、柑橘[17]等作物的指紋圖譜。然而，SSR技術(shù)必須知道重復序列兩端的單拷貝序列才能設計特異引物用于擴展檢測，因此其開發(fā)費用較高。

1.5 簡單序列重復間擴增多態(tài)性(ISSR)

ISSR是在SSR基礎上發(fā)展的一種新型分子標記，1994年由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz 等[18]提出。ISSR標記以基因組中SSR本身為引物，在SSR序列的3’或5’端加錨2～4個隨機核苷酸，利用錨定引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA片段。ISSR結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點，成本低，DNA用量少；試驗操作簡單、快速、高效；遺傳多態(tài)性高，重復性好；顯性標記，呈孟德爾式遺傳；不需要知道任何靶標序列的SSR背景信息。目前，利用ISSR構(gòu)建了水稻[19]、玉米[20]、小菊[21]等作物指紋圖譜。但是它與RAPD相似，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

1.6 相關序列擴增多態(tài)性(SRAP)

SRAP是2001年由美國加州大學科學家Li等[22]開發(fā)的，其基本原理是根據(jù)基因外顯子GC含量豐富而啟動子和內(nèi)含子AT含量豐富的特點設計引物，對基因組開放閱讀框(Open Reading Frames, ORFs)進行擴增，上下游引物分別對外顯子區(qū)域和內(nèi)含子、啟動子區(qū)域進行特異擴增，因不同個體或物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不同產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP分布均勻，多態(tài)性強，DNA需要量少，共顯性，簡單且花費少。目前已成功地應用于多種作物的指紋圖譜構(gòu)建，如國蘭[23]、南瓜[24]等。但是，SRAP是對ORFs進行擴增，對著絲粒附近以及端粒的擴增會較少。同時，沒有利用擴增區(qū)域序列的任何信息，產(chǎn)生的分子標記是隨機地分布在染色體上的。

1.7 單核苷酸多態(tài)性(SNP)

1996年，美國學者Lander[25]提出SNP為新一代分子標記，SNP是指基因組單個核苷酸(A，T，C，G)的置換或顛換所引起的DNA序列多態(tài)性，通常所說的SNP不包括堿基的插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化[26]。SNP是繼RFLP和SSR之后發(fā)展起來的第3代標記技術(shù)，具有以下優(yōu)點：數(shù)量多，分布廣泛；遺傳穩(wěn)定性高；二態(tài)性，非此即彼，易于快速且高通量地進行基因型分型。SNP是國際植物新品種權(quán)保護聯(lián)盟(UPOV)BMT分子測試指南中構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標記之一。SNP已在油菜[27]、甜菜[28]等作物指紋圖譜構(gòu)建中使用。利用DNA芯片技術(shù)是檢測SNP的最佳方法，隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展，SNP有望成為最重要最有效的分子標記技術(shù)。但是，制作SNP圖譜要求個體多，成本高；功能難以確定；涉及專利問題。

2 構(gòu)建指紋圖譜的指紋代碼方法

2.1 標記擴增圖譜中位點條帶直接轉(zhuǎn)化為“0, 1”數(shù)字串指紋

該方法是根據(jù)每個品種DNA擴增圖譜中標記位點條帶的有無或缺失用0和1進行數(shù)字化統(tǒng)計，結(jié)果為由0和1排列形成的字符串，構(gòu)成一個品種的數(shù)字指紋圖譜。如繆恒彬等[21]采用此方法構(gòu)建了25個小菊品種的ISSR指紋圖譜，張婉等[29]利用該方法構(gòu)建了70個白菜品種的SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。該方法較為簡單，但數(shù)據(jù)統(tǒng)計工作量較大，并且對不同大小條帶的統(tǒng)計存在誤差，對未知樣品進行鑒定時需要逐一對比“0, 1”數(shù)字串，比較麻煩。

2.2 標記擴增特征帶、特異譜帶類型和多引物組合，共同組成“0, 1”數(shù)字串指紋

該方法是統(tǒng)計的譜帶結(jié)果，篩選具有特征帶的特異標記和擴增產(chǎn)物多態(tài)性好、產(chǎn)生豐富的譜帶類型，然后再利用不同的引物擴增產(chǎn)生的譜帶組合，確定核心引物，將核心引物的特征譜帶轉(zhuǎn)化為“0, 1”數(shù)字串指紋。如李雪蓮等[30]應用該法構(gòu)建了23個兩用桃品種(系)的指紋圖譜；匡猛等[31]采用該方法構(gòu)建了32份棉花主栽品種的指紋圖譜。該方法構(gòu)建圖譜、鑒定未知樣品均較簡單，但其需要較多的引物才能取得足夠的特異位點，試驗成本高，工作量大。

2.3 十進制數(shù)字串條形碼

該方法根據(jù)電泳結(jié)果采用“0, 1”系統(tǒng)記錄譜帶位置，將每對引物在品種間擴增得到“0, 1”(二進制)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成十進制數(shù)據(jù)，該十進制數(shù)據(jù)代表每個引物擴增的結(jié)果，核心引物組合的十進制數(shù)字串作為每一個品種的數(shù)字指紋。如聶新輝等[32]利用該方法構(gòu)建了51個新陸早系列常規(guī)棉花新品種的DNA指紋圖譜；潘兆娥等[33]采用此法構(gòu)建了中棉所48的數(shù)字指紋圖譜。該方法實際上是本文2.1小節(jié)所述方法的改進，方便數(shù)據(jù)觀察和比對，但統(tǒng)計條帶時較為麻煩。

2.4 標記字母編號和分子量相結(jié)合編碼

該方法首先統(tǒng)計每份材料引物擴增條帶分子量大小，再將引物進行編號，如果一份材料經(jīng)同一引物擴增同時出現(xiàn)多條條帶，則用“-”連接，無條帶則為0，每個材料的DNA經(jīng)不同的引物擴增后會形成由字母和數(shù)字組成的一系列帶型編號，便形成了該材料的指紋圖譜代碼。如宋海斌等[34]應用該方法構(gòu)建了105份甜瓜品種(系)的指紋圖譜庫；王靜毅等[35]采用該法繪制了56份香蕉種質(zhì)的指紋圖譜。該方法也是對本文2.1小節(jié)所述方法的改進，方便記錄和數(shù)據(jù)參考利用，但仍需繁瑣的統(tǒng)計條帶。

2.5 指紋圖譜分析軟件自動編碼

該方法是首先將實驗中獲得的電泳圖轉(zhuǎn)化為由“0, 1”描述的數(shù)據(jù)，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，然后導入DNA指紋圖譜分析軟件進行多態(tài)性與特異性分析，獲得個體的指紋圖譜。劉娟等[36]應用該方法構(gòu)建了48個新疆杏品種(系)指紋圖譜；徐宗大等[37]利用該方法構(gòu)建了50個玫瑰種質(zhì)的分子指紋圖譜。該方法分析快速準確，減少了指紋圖譜繪制時間，降低了人工觀察可能產(chǎn)生的誤差，但需要開發(fā)軟件。

3 DNA指紋圖譜在甘蔗育種中的應用

3.1 甘蔗品種鑒定和真實性檢測

目前，在中國種植的主要甘蔗栽培品種遺傳胞質(zhì)基本來自“甘蔗高貴化育種”過程的后代，品種間生物學特性差異較小。再加上骨干親本的重復使用，新基因資源的缺乏，甘蔗品種間的遺傳差異越來越小，使得單純依據(jù)形態(tài)性狀進行品種田間檢驗越來越困難。利用分子標記構(gòu)建甘蔗DNA指紋圖譜為甘蔗品種鑒定和真實性檢測提供了一種有效的手段，不少學者利用分子標記構(gòu)建指紋圖譜對甘蔗品種進行了鑒定，Piperidis等[38]利用SSR標記構(gòu)建了180個甘蔗品種的指紋圖譜庫并應用于品種鑒定；Da Silva[39]等利用SSR標記構(gòu)建指紋圖譜對3個甘蔗品種(系)進行了鑒定；劉新龍等[40]從120對SSR標記中篩選出8對核心引物，構(gòu)建了27份云南自育品種DNA指紋圖譜，并用10個甘蔗主栽品種對3個高效引物組合進行驗證。

3.2 甘蔗品種親緣關系和分類研究

現(xiàn)代栽培甘蔗品種是遺傳背景非常復雜的多倍體或非整倍體，均由種間雜交育成。甘蔗親本系譜在一定程度上能反映品種之間的親緣關系，是雜交組合選配的重要依據(jù)之一，但由于自交、串粉等因素，存在一定的局限性?；诜肿铀降挠H緣關系較基于系譜的親緣關系具有更高的可靠性[41-42]。根據(jù)品種間DNA指紋圖譜的差異程度可判斷品種間親緣關系的遠近和測量品種間遺傳距離，進行系譜分析，并可據(jù)此進行分類研究。一些研究人員利用甘蔗DNA指紋圖譜對甘蔗種質(zhì)進行了親緣關系和分類研究，莊南生等[43]采用AFLP構(gòu)建了54份種質(zhì)(14份祖親種、40份栽培品種或品系)的指紋圖譜，并分析了不同種質(zhì)的相似系數(shù)和親緣關系，探討了甘蔗種質(zhì)系譜與聚類分析的關系以及斑茅種的分類地位問題；王英等[44]采用ISSR分子標記技術(shù)構(gòu)建了96份甘蔗種質(zhì)(39份祖親種、57份栽培品種或品系)的ISSR指紋圖譜，以及不同種質(zhì)的親緣關系；Pan等[45]利用21個SSR標記對116個甘蔗品種進行了遺傳多樣性分析和親緣關系分析；鄭益鳳[41]利用SSR熒光標記構(gòu)建了116個甘蔗常用親本、創(chuàng)新親本或新親本的DNA指紋圖譜，并對這些種質(zhì)材料進行了聚類分析、主成分分析和遺傳相似性分析，獲得了這些甘蔗親本的遺傳多樣性信息；王英等[46]采用RAMP分子標記技術(shù)對80份甘蔗種質(zhì)(32份祖親種、48份栽培品種或品系)的遺傳基礎進行了分析，構(gòu)建了甘蔗80份種質(zhì)的RAMP指紋圖譜，并分析了不同種質(zhì)的遺傳關系，同時在栽培種中檢測到部分熱帶種、野生種及斑茅種特異片段，初步證明了外源基因已導入甘蔗栽培種中；姚春雪等[47]利用SSR技術(shù)構(gòu)建了67份甘蔗與蔗茅雜交不同世代的指紋圖譜，討論了品種之間同源關系與聚類分析；昝逢剛等[48]利用AFLP技術(shù)分析了98份甘蔗種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關系。

4 存在問題及展望

DNA指紋圖譜技術(shù)在作物品種資源中己得到廣泛地應用，但甘蔗基因組龐大，結(jié)構(gòu)復雜，甘蔗分子育種研究進展較為緩慢[49]，阻礙了DNA指紋圖譜在甘蔗種質(zhì)資源中的應用。隨著DNA標記技術(shù)的發(fā)展，甘蔗種質(zhì)遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、分子標記鑒定品種等也會得到快速發(fā)展。目前，大多數(shù)DNA指紋圖譜檢測技術(shù)仍比較煩瑣，限制了該技術(shù)在育種中的大規(guī)模應用。隨著分子生物學新儀器的研制和生物信息學的應用，一些研究單位研發(fā)了自動化程度的檢測儀器，開發(fā)了指紋圖譜分析軟件，從加樣到數(shù)據(jù)分析全過程實現(xiàn)人工智能控制，大大提高了DNA指紋圖譜檢測的效率與準確性[1]。

甘蔗是我國主要的糖料作物，甘蔗蔗糖產(chǎn)量約占中國食糖總量的92%，我國甘蔗品種遺傳基礎極為狹窄，嚴重制約甘蔗產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展[50]。同時，中國在甘蔗品種資源生產(chǎn)和經(jīng)營方面尚不規(guī)范，品種引種混亂或品種造假的現(xiàn)象時有發(fā)生。構(gòu)建甘蔗品種DNA指紋圖譜能夠準確和全面地了解中國甘蔗品種的遺傳多樣性，為針對性地開展親本引進、創(chuàng)新和配置雜交組合提供重要參考，促進甘蔗育種發(fā)展；通過構(gòu)建中國甘蔗品種身份證，為種質(zhì)資源的保護、完善系譜、品種鑒定提供支撐。

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(本篇責任編校：李金玉)

DNA Fingerprinting Technology and Its Application in Sugarcane Breeding

WU Jian-tao1,2, WANG Qin-nan1,2, ZHOU Feng1,2, XIE Jing1,2, XU Huan-yin1,2, CHANG Hai-long1,2
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316;2Scientific Observation Test Station of Sugarcane Germplasm Resources and Utilization, Ministry of Agriculture, Sanya, Hainan 572025)

Abstract:DNA fingerprinting technologies have been rapidly developed with the development and utilization of kinds of new DNA molecular markers recently. This paper briefly reviewed the basic principle, advantages and disadvantages, application of several molecular markers in constructing DNA fingerprinting. Five methods to build fingerprint code and their application in sugarcane breeding were summarized. In addition, the problems existing in the application of DNA fingerprinting technology and outlook were also briefly discussed.

Keywords:DNA fingerprinting; Molecular marker; Sugarcane breeding; Application

作者簡介：吳建濤(1983-)，男，農(nóng)藝師；E-mail：wujiantao2010@163.com

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金(CARS-20-1-6)；廣東省科技計劃項目(2015A030303005?2014A030304026?2013B020311002?2013B060400027和粵科財字[2013]82號)；廣州市科技計劃項目(2014J4100227)

收稿日期：2015-12-26；修回日期：2016-02-02

中圖分類號：S566.1

文獻標識碼：A

文章編號：1005-9695(2016)01-0001-06

引文格式：吳建濤，王勤南，周峰，等. DNA指紋圖譜技術(shù)及其在甘蔗育種上的應用[J]. 甘蔗糖業(yè)，2016(1)：1-6.