劉哲+許園園+蘇小俊

摘要：利用抽薹性狀差異較大的晚抽薹蘿卜品種L2和早抽薹蘿卜品種E6配制雜交組合，構(gòu)建F2群體。通過田間調(diào)查，選用極晚和極早抽薹單株分別構(gòu)建晚抽池（BSA-1）和早抽池（BSA-2），用288對SRAP組合對兩親本進行PCR分析，共篩選出166對SRAP引物組合。通過2個基因池及基因池中各單株對篩選出的引物進行復(fù)篩，獲得引物組合me3+em9，其在晚抽池中可擴增出多態(tài)性片段LB；對156株F2單株進行驗證發(fā)現(xiàn)，LB與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM。

關(guān)鍵詞：蘿卜；晚抽薹；分子標記；遺傳距離

中圖分類號： Q943；S631.103文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0074-03

抽薹開花是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個重要現(xiàn)象，不僅對植物生殖器官的形成起關(guān)鍵作用，而且關(guān)乎到植物的生物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)。先期抽薹在十字花科作物栽培上是一個倍受關(guān)注的問題，不僅會降低十字花科作物的生物產(chǎn)量，而且會影響到產(chǎn)品的品質(zhì)，晚抽薹是十字花科作物一個重要的育種目標[1]。生物技術(shù)的發(fā)展給作物遺傳育種研究帶來巨大變化，分子標記技術(shù)的應(yīng)用是其中之一。分子標記具有位點豐富、多態(tài)性高、穩(wěn)定可靠等特點，且檢測不受時間和性狀表達限制，可鑒別基因型的純合或雜合。本研究利用與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標記可以方便準確識別不同晚抽薹基因的特點，通過群體分離分析法（BSA）篩選出與晚抽薹蘿卜基因緊密連鎖的分子標記，以實現(xiàn)分子標記輔助育種，減少蘿卜選育過程中對表型性狀的依賴，從而大大提高蘿卜的育種效率。

1材料與方法

1.1材料

蘿卜晚抽薹品種L2，為韓國白玉春蘿卜第9代自交系；早抽薹品種E6，為短葉13蘿卜第10代自交系，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。將晚抽薹與早抽薹親本進行雜交再自交，形成F2分離世代群體共計156株單株。引物由上海英俊進行合成；dNTPs、TaqDNA聚合酶等分子生物學(xué)試劑，均購于TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取與檢測試驗于2014年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進行，基因組DNA提取采用改良的CTAB法。采用DYY-Ⅲ-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，緩沖液為1.2%TAE，瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時電壓100 V（5 V/cm），時間為1 h。電泳結(jié)束，在 FR-200 紫外可見分析裝置上檢測、照相，記錄結(jié)果。

1.2.2SRAP反應(yīng)采用優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系，SRAP引物序列參考Li等信息[2-3]。PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L上、下游引物，0.6 U TaqDNA聚合酶，20 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序為94 ℃變性3 min；94 ℃ 60 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，5個循環(huán)；94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V預(yù)電泳30 min，160 V電泳2.5 h。凝膠中含有Arc ∶[KG-*3]Bis為29 ∶[KG-*3]1 6.65 mL，5×TBE 5 mL，TEMED 20 μL，10%AP 0.3 mL。1×TBE電泳緩沖液配方（1 L）為：0.054 g Tris，0027 5 g硼酸，0.25 mol/L EDTA 0.04 mL，pH值為8.0。電泳結(jié)束，采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定15～20 min，0.2% AgNO3溶液染色12～15 min；蒸餾水洗滌2次，于含1.5%NaOH、0.4%甲醛、0.002% Na2S2O3的顯影液中顯影，白熾燈箱下觀察拍照。

1.2.3引物篩選利用蘿卜晚抽薹品種代號L2和早抽薹品種E6的DNA為模板，從現(xiàn)有288對SRAP引物中篩選出雙親間存在多態(tài)性、條帶清楚、易于識別、可以穩(wěn)定擴增的引物；基于抽薹性狀表現(xiàn)型，在F2群體中選取極早抽薹和極晚抽薹單株各10株，構(gòu)建早抽池（BSA-1）及晚抽池（BSA-2），待幼苗長至5葉1心時提取DNA，等量混合；分別提取各單株基因組DNA，以早抽池、晚抽池及2個基因池中各單株 DNA 為模板，對篩選出的多態(tài)性引物進行再次篩選，尋找可能與目標基因連鎖的標記；用獲得的DNA標記對F2群體進行標記。PCR 產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計及連鎖分析

用篩選到的具有多態(tài)性引物組合對待檢測F2群體的DNA樣品進行PCR擴增，統(tǒng)計有差異、易于識別的多態(tài)性條帶，有帶記為1，無帶記為0。田間調(diào)查時，分別以1、0記錄晚抽薹、早抽薹的植株；根據(jù)引物擴增結(jié)果，建立SRAP數(shù)據(jù)庫；使用Joinmap 4.0分析分子標記，設(shè)最小LOD值為3.0，并用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換成圖距單位（cM）。

2結(jié)果與分析

[FL（2K2]em9進一步驗證，各標記在分離群體中并非表現(xiàn)為全有和全無的差別，有少數(shù)晚抽薹蘿卜單株未能擴增出差異條帶，同樣也有少數(shù)早抽薹單株擴增產(chǎn)生差異條帶。用Joinmap 4.0軟件對分子標記進行分析得知，me3+em9與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM（圖4）。

3結(jié)論與討論

分子標記技術(shù)與其他分子生物學(xué)研究相比，具有簡單快捷的優(yōu)點。相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）是Li等[2]發(fā)展的一種分子標記方法，具有簡便、產(chǎn)率高、可顯示大量的共顯性標記、易從序列中得到分離條帶等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、基因克隆和遺傳多樣性等研究[4-9]。Li等在對羽衣甘藍×花椰菜的RI系構(gòu)建遺傳圖譜時，用SRAP成功標記了芥子油脫飽和基因BoGLSALK，該基因在圖譜Ll連鎖群上距SRAPl33標記為1.4 cM[7]。另外，研究人員在中國白菜中發(fā)現(xiàn)了1個與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標記，在油菜中篩選到1個與恢復(fù)基因連鎖的SRAP標記，在芹菜中獲得1個與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標記[10]。

抽薹性狀屬于數(shù)量性狀遺傳，易受環(huán)境條件的限制影響。目前，利用分子標記技術(shù)對抽薹性狀的研究已有諸多報道。Ken等通過甘藍和青花菜的F2群體RFLP連鎖圖，鑒定出控制從種植至現(xiàn)蕾天數(shù)的主效基因位于第2、第7連鎖群上，從種植到現(xiàn)蕾的天數(shù)、現(xiàn)蕾到開花的天數(shù)這2個性狀的許多標記位點密切相關(guān)。曹維榮等運用RAPD技術(shù)，采用混合分離群體法（BSA）對甘藍遲抽蔓基因相連鎖的分子標記進行研究，得到與甘藍遲抽蔓基因相連鎖的RAPD標記Nl-750，其連鎖距離為7.9 cM[11]。卓祖闖等運用RAPD、SRAP、RSAP、SSR、SCAR技術(shù)，采用BSA法對大白菜晚抽蔓基因緊密連鎖的分子標記進行研究，分別獲得1個晚抽蔓基因緊密連鎖的RAPD標記和RSAP標記，同時獲得1個與早抽蔓基因連鎖的SRAP標記[12]。

本研究中，從288對引物中篩選獲得116對可以在雙親間穩(wěn)定擴增出清晰條帶、表現(xiàn)出多態(tài)性的引物組合，多態(tài)率為40.3%；將116對引物的PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯凝膠酰胺電泳構(gòu)建圖譜，共得到條帶285條，其中多態(tài)性條帶為66條，多態(tài)率為23.2%，每對引物擴增出的條帶數(shù)量范圍為0～40，多態(tài)性條帶的數(shù)量范圍為0～5，得到與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標記1個，其遺傳距離為5.7 cM。這為以后的蘿卜晚抽薹育種提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻：[HJ1.78mm]

[1]黃細松. 白菜開花時間相關(guān)基因的分子標記及春化相關(guān)基因的克隆和表達分析[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2006.

[2]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorhism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2）：455-461.

[3]張波. 不結(jié)球白菜晚抽蔓分子標記及抽蓄性遺傳分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[4]劉雅輝，閆紅飛，楊文香，等. 小麥抗葉銹病基因[WTBX][STBX]Lr19[WTBZ][STBZ]的SRAP標記[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2007，22（4）：193-196.

[5]陳暉，陳美霞，陶愛芬，等. 長果種黃麻SRAP標記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及3個質(zhì)量性狀基因定位[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（12）：2422-2430.

[6]Yeboah M X. A genetic linkage map of cucumber （Cucumis sativus L.） combining SRAP and ISSR markers[J]. African Journal of Biotechnology，2007（6）：2784-2791.

[7]Li G，Gao M，Yang B，et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，107（1）：168-180.

[8]Xu L，Wang L J，Gong Y Q，et al. Genetic linkage map construction and QTL mapping of cadmium accumulation in radish （Raphanus sativus L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，125（4）：659-670.

[9]張冬菊，李世超，吳鵬夫，等. 基于表型和SRAP標記的切花菊品種遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報，2014，41（1）：118-130.[ZK）]

[10]柳李旺，龔義勤，黃浩，等. 新型分子標記SRAP與TRAP及其應(yīng)用[J]. 遺傳，2004，26（5）：777-781.

[11]曹維榮，王超. 甘藍遲抽薹基因的RAPD標記[J]. 生物技術(shù)通報，2007（5）：167-169.

[12]卓祖闖，萬恩梅，張魯剛，等. 大白菜抽薹性狀的主基因+多基因遺傳分析[J]. 西北植物學(xué)報，2009，29（5）：923-928.