王鵬超，肖樹偉，符偉軍，王忠新，洪寶發(fā)，張旭

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 100853；2.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院泌尿外科，海南 三亞 572013)

·論 著·

可降解輸尿管支架材料的特性研究

王鵬超1，肖樹偉1，符偉軍2，王忠新2，洪寶發(fā)1，張旭1

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 100853；2.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院泌尿外科，海南 三亞 572013)

目的 構(gòu)建一種生物可降解輸尿管載藥支架材料，并研究其體內(nèi)外降解特性、藥物釋放特性及組織相容性。方法乙交酯-L-丙交酯-ε-己內(nèi)酯三元無規(guī)共聚物材料、雷帕霉素共溶于三氯甲烷溶液中，溶液蒸發(fā)法制備兩種規(guī)格載藥支架材料。將材料浸泡于體外尿液環(huán)境中，恒溫振蕩2、4、6、8、10周后，通過大體形態(tài)、電鏡掃描觀察材料的體外降解情況；通過高效液相色譜測定材料載藥量變化研究材料藥物釋放特性。將材料包埋于兔兩側(cè)椎旁肌，于1、4、12周時手術(shù)取出材料行組織染色切片研究材料的組織相容性。結(jié)果體外振蕩環(huán)境下，4周時管內(nèi)可見絮狀漂浮物，此時質(zhì)量丟失率約為27%，掃描電鏡下材料表面可見細小孔洞，10周時材料降解為泥沙樣沉積物。支架載藥量逐漸降低，0周組(1 412±28)μg與2周組(1 335±74)μg載藥量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，2周組與4周組(1 165±84)μg、4周組與6周組(622±25)μg、6周組與8周組(286±17)μg載藥量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。組織學切片觀察急性期表現(xiàn)為手術(shù)損傷后炎癥反應，植入后期纖維增生不明顯。結(jié)論新型生物可降解輸尿管載藥支架材料肌肉包埋組織學反應輕微，具有良好的組織相容性，體外環(huán)境下其在降解同時，能持續(xù)釋放雷帕霉素達8周。

輸尿管支架；藥物載體；降解；藥物釋放特性；組織相容性

雙J管支架治療輸尿管損傷在臨床上最為常見，在保持尿液引流、保護腎功方面具有確切效果[1]，但雙J管的使用會伴隨著一些并發(fā)癥出現(xiàn)，如置管后不適、支架移位、泌尿道感染、膀胱輸尿管返流等[2]，影響患者的疾病治療效果和生活質(zhì)量。本課題采用生物可降解材料復合抗增生藥物構(gòu)建新型生物可降解輸尿管載藥支架材料，并評價該材料的降解特性、藥物釋放特性及組織相容性，為構(gòu)建具有降解時間可靠、藥物釋放可控的輸尿管支架提供基礎支持。

1 材料與方法

1.1 生物可降解輸尿管載藥支架材料的制備 采用乙交酯-L-丙交酯-ε-己內(nèi)酯三元無規(guī)共聚物材料、純品雷帕霉素，共溶于三氯甲烷溶液中，溶液蒸發(fā)法制備成厚0.4 mm載藥薄膜。分別均勻切割為10 mm×5 mm及10 mm×3 mm大小載藥材料，測量干重后環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2 載藥支架材料體外降解觀察及藥物釋放研究 取25枚載藥支架材料(10 mm×5 mm)，分別置于5 mL離心管中編號，并隨機分五組，管內(nèi)添加健康成年志愿者尿液，置于恒溫震蕩器中(37℃、90 r/min)中振蕩，每天更換新鮮尿液并記錄降解情況；于振蕩2、4、6、8、10周后分別取出一組，充分凍干觀察，任取1枚噴金后進一步行掃描電鏡下觀察其降解情況；剩余4枚用足量氯仿溶解，采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測其載藥量，研究其藥物釋放性能。主要觀察指標：(1)輸尿管載藥支架材料降解過程中大體形態(tài)和色澤變化；(2)載藥支架材料失重率：失重率=(初重-殘重)/初重× 100%(實驗前材料的原始質(zhì)量為初重，每一觀察點材料充分冷干后稱重為殘重)；(3)掃描電鏡下觀察材料降解過程的微觀形態(tài)變化；(4)載藥支架材料的載藥量測定。

1.3 載藥支架材料的體內(nèi)降解及組織學觀察 健康新西蘭兔6只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3 kg，隨機分為三組，術(shù)前1 d剃除背毛，術(shù)前以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈麻醉消毒后，于兔椎旁肌做2 cm長縱切口，分離達深筋膜，在肌肉上鈍性分離出肌袋，左右各3個，將生物可降解輸尿管載藥支架材料(10 mm×3 mm)植入肌袋內(nèi)，材料長軸均延肌肉紋理，各3枚，材料距離中線25 mm，材料間相距2.5 mm以上。術(shù)后連續(xù)抗感染3 d，觀察實驗兔術(shù)后一般指標及植入?yún)^(qū)情況。分別于植入后1、4、12周隨機處死一組，取出材料及周圍肌肉組織，行常規(guī)病理組織切片，蘇木素-伊紅(H&E)染色，觀察材料與周圍組織的組織相容性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定量資料統(tǒng)計描述采用均數(shù)±標準差(±s)表示，載藥量比較采用One-Way ANOVA，多重比較采用S-N-K法，設定顯著性水平α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 載藥支架材料體外降解觀察及質(zhì)量變化 材料初始為半透明色，表面光整有光澤，質(zhì)地堅韌，掃描電鏡下材料結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，未見明顯腔隙、裂痕(圖1A)；浸泡振蕩2周后，材料成瓷白色，失去透明性，表面光澤消失，質(zhì)地變硬；4～6周，管內(nèi)開始出現(xiàn)少許白色絮狀沉積物，隨時間推移逐漸增多，掃描電鏡下支架材料表面可見細小孔洞分布，大小不一，無規(guī)律分布，未見明顯腔隙、裂痕(圖1B)；8周后，材料表面肉眼可見明顯裂痕及斷裂，掃描電鏡下材料表面可見蛛網(wǎng)樣裂紋，以及鱗屑狀脫落物(圖1C)；10周材料降解為白色絮狀或泥沙狀沉積物。材料質(zhì)量丟失速率表現(xiàn)為4周前相對緩慢，4周后出現(xiàn)加速的趨勢，4周組質(zhì)量丟失率為27%，10周組質(zhì)量已無法精確測量。

2.2 載藥支架材料載藥量變化 體外人體尿液環(huán)境中浸泡及振蕩，支架材料的載藥量逐漸降低，0周載藥量為(1 412±28)μg，2周載藥量為(1 335±74)μg，4周載藥量為(1 165±84)μg，6周載藥量為(622±25)μg，8周載藥量為(286±17)μg；0周與2周組間差異無統(tǒng)計學意義(q=2.85，P＞0.05)，2周與4周(q=6.30，P＜0.01)、4周與6周(q=20.21，P＜0.01)、6周與8周(q=12.48，P＜0.01)組間差異均有統(tǒng)計學意義。

2.3 載藥支架材料的組織學觀察 術(shù)后連續(xù)觀察，實驗兔一般情況平穩(wěn)，切口愈合良好，未見感染及植入物排出征象。術(shù)后1周肌袋內(nèi)有炎性細胞浸潤，無組織壞死，無纖維組織包繞(圖2A)。術(shù)后4周，植入物部分被微薄的纖維膜包裹。術(shù)后12周，交界面可見完整的纖維膜。載藥(雷帕霉素)支架材料的組織學反應較輕，纖維增生不明顯(圖2B)。

圖1 載支架材料電鏡掃描結(jié)果(×300)

圖2 載藥支架材料組織學檢查結(jié)果(×200)

3 討 論

輸尿管支架在泌尿系統(tǒng)疾病的治療中非常常見，如開放性手術(shù)后、良性或惡性梗阻、輸尿管損傷、腔內(nèi)碎石取石術(shù)后等。為了消除輸尿管支架使用中經(jīng)常伴隨出現(xiàn)的并發(fā)癥，泌尿外科醫(yī)生一直致力于尋找一種“理想支架(Ideal stents)”。理想的輸尿管支架應該滿足以下條件：①可靠的機械性能，并承擔良好的尿液引流管作用；②具有良好的組織相容性；③較少引起生物膜、衣殼等并發(fā)癥，不影響患者的生活質(zhì)量；④易于置入和取出，且價格經(jīng)濟；⑤具有X光顯像或B超下可見等特性[3]。迄今尚未發(fā)現(xiàn)一種完全符合上述需求的支架。目前的輸尿管支架根據(jù)其構(gòu)成材質(zhì)的不同大致區(qū)分為：人工多聚物材料支架、金屬材料支架、涂層支架與藥物釋放支架、天然材料支架、組織工程支架等。生物可降解輸尿管支架采用生物可降解材料，相比于雙J管支架或金屬支架具有以下特點：①其在體內(nèi)可以完全降解并最終轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水，對人體無毒，材料的可降解特性，也避免了微創(chuàng)手術(shù)二次取管的問題[4-5]；②由于其不跨越膀胱輸尿管連接部，避免了膀胱輸尿管返流的發(fā)生；③通過對其構(gòu)成的調(diào)整，可以有效地調(diào)節(jié)支架的體內(nèi)外降解時間，以獲得最佳的體內(nèi)降解時間；④所選用的生物可降解材料組織相容性優(yōu)于雙J管支架材料。而相比于生物工程輸尿管支架，生物可降解輸尿管支架在材料獲得、支架構(gòu)建、性能調(diào)控等方面均有明確優(yōu)勢，且其研究最接近于產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；虼司哂猩钊胙芯康闹匾R床意義。目前國內(nèi)外輸尿管可降解支架研究常用的生物可降解高分子材料，主要如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)等[6-9]。本課題組前期采用混合聚乳酸材料構(gòu)建的生物可降解輸尿管支架，具有良好的力學性能和藥物荷載能力，在治療輸尿管彈片傷過程中，有效起到支撐、引流作用，并隨時間推移逐漸降解[10-11]。

藥物洗脫支架在心血管領域的廣泛研究及臨床應用，為泌尿外科醫(yī)生提供了新研究方向。雷帕霉素是一種脂溶性藥物，被細胞攝取后可以在細胞內(nèi)長時間擴散和潴留，發(fā)揮抗增殖作用。成纖維細胞和平滑肌細胞在纖維化瘢痕形成過程中都起著重要作用，雷帕霉素能夠阻斷細胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制其增殖、遷移和生物活性功能[12]。在心血管領域證實雷帕霉素能夠抑制組織增生反應，雷帕霉素緩釋支架已用于治療冠狀動脈粥樣硬化，并通過大規(guī)模臨床實驗證實其可有效降低置入術(shù)后再狹窄的發(fā)生[13]。然而，輸尿管有不同結(jié)構(gòu)和組織學特征，以及牽連的病理生理機制。因此，心血管支架的發(fā)展可能會需要進一步細化，才有可能為輸尿管支架的發(fā)展提供助力。藥物洗脫支架其作用原理在于通過荷載并釋放特殊藥物到損傷輸尿管局部，達到特殊治療效果，同時其局部直接給藥方式，能有效避免其他給藥方式可能引起的全身性影響。而隨著其負荷藥物的不同，該類型支架也具有不同的特性，主要為抗炎和抗組織增生兩種。國內(nèi)外學者通過將多類藥物荷載于輸尿管支架，獲得了多種具有特殊功效的新型輸尿管藥物洗脫支架，并將新型支架用于動物體內(nèi)驗證其具體作用[14-16]。

本實驗將生物可降解材料與藥物洗脫技術(shù)相結(jié)合，采用乙交酯-L-丙交酯-ε-己內(nèi)酯三元無規(guī)共聚物材料與純品雷帕霉素共混的方式構(gòu)建了新型可降解輸尿管載藥支架材料，并模仿體內(nèi)尿液環(huán)境研究其降解特性和藥物釋放特性，材料隨時間逐步降解，前期降解較慢，至10周時完全降解為泥沙樣物質(zhì)。而伴隨著材料的降解，雷帕霉素逐步釋放，藥物前4周釋放量少，后期釋放加速，其釋放符合損傷后瘢痕修復的一般規(guī)律，未出現(xiàn)不釋藥或者過早釋藥現(xiàn)象。通過兔脊柱旁肌包埋研究其組織相容性，可以看到藥物支架材料，其炎癥反應輕，具有良好的組織相容性。

組織工程化技術(shù)是現(xiàn)代修復醫(yī)學研究的前沿領域，但目前研究進展局限于組織工程材料的選擇、種子細胞的獲得、復合支架的構(gòu)建等難題，且我國基礎應用研究還比較薄弱。相比于組織工程輸尿觀研究，可降解輸尿管支架的研究具有更迫切的醫(yī)學研究意義。本實驗通過將可降解材料與藥物洗脫技術(shù)結(jié)合構(gòu)建的輸尿管可降解載藥支架材料，在降解時間、釋藥潛力和組織相容性等方面均達到預期目的，為下一步制備可降解輸尿管藥物洗脫支架提供支持。

[1]Yachia D.Recent advances in ureteral stents[J].Curr Opin Urol, 2008,18(2):241-246.

[2]Lawrentschuk N,Russell JM.Ureteric stenting 25 years on:routine or risky?[J].ANZ J Surg,2004,74(4):243-247.

[3]王鵬超,符偉軍,洪寶發(fā),等.輸尿管支架的應用進展[J].海南醫(yī)學, 2014,25(20):3028-3030.

[4]Isotalo T,Nuutinen JP,Vaajanen A,et al.Biocompatibility and implantation properties of 2 differently braided,biodegradable,self-reinforced polylactic acid urethral stents:an experimental study in the rabbit[J].J Urol,2005,174(6):2401-2404.

[5]Tayrac R,Chentouf S,Garreau H,et al.In vitro degradation and in vivo biocompatibility of poly(lactic acid)mesh for soft tissue reinforcement in vaginal surgery[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2008,85(2):529-536.

[6]Chew BH,Paterson RF,Clinkscales KW,et al.In vivo evaluation of the third generation biodegradable stent:a novel approach to avoiding the forgotten stent syndrome[J].J Urol,2013,189(2):719-725.

[7]Chew BH,Davoudi H,Li J,et al.An in vivo porcine evaluation of the safety,bioavailability,and tissue penetration of a ketorolac drug-eluting ureteral stent designed to improve comfort[J].J Endourol,2010, 24(6):1023-1029.

[8]張龍,王曉慶,姜鳳鳴,等.電紡納米纖維可降解輸尿管支架肌肉埋植的降解性能[J].中國組織工程研究與臨床康復,2012,16(3):401-404.

[9]王曉慶,張龍,侯宇川,等.電紡絲法PLGA可降解輸尿管支架的制備及體外降解研究[J].中國醫(yī)科大學學報,2011,40(9):784-786,815.

[10]王忠新,譚海頌,曹磊,等.新型生物可降解雷帕霉素藥物洗脫輸尿管支架的構(gòu)建及性能評估[J].海南醫(yī)學,2014,25(18):2663-2666.

[11]李鋼,符偉軍,洪寶發(fā),等.生物可降解輸尿管支架在輸尿管戰(zhàn)創(chuàng)傷治療中的降解特性[J].中華實驗外科雜志,2010,27(3):333-335.

[12]Sandrine F,Guido K,Eric R.Current development of mTOR inhibitors as anticancer agents[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(8):671-688.

[13]Franz-Josef N,Walter D,Eberhard G,et al.Effectiveness and safety of sirolimus-eluting stents in the treatment of restenosis after coronary stent placement[J].Circulation,2005,111(16):2107-2111.

[14]Kallidonis P,Kitrou P,Karnabatidis D,et al.Evaluation of zotarolimus-eluting metal stent in animal ureters[J].J Endourol,2011,25(1): 1661-1667.

[15]Elayarajah,Rajendran R,Venkatrajah,et al.Biodegradable tocopherol acetate as a drug carrier to prevent ureteral stent-associated infection[J].Pak J Biol Sci,2011,14(5):336-343.

[16]符偉軍,曹磊,徐福強,等.攜帶緩釋藥物的生物可降解輸尿管支架體內(nèi)外降解特性研究[J].中華實驗外科雜志,2010,27(11):1716-1718.

Characterization of biodegradable ureteral scaffold material as drug carrier.

WANG Peng-chao1,XIAO Shu-wei1, FU Wei-jun2,WANG Zhong-xin2,HONG Bao-fa1,ZHANG Xu1.1.Department of Urology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,CHINA;2.Department of Urology,Hainan Branch,General Hospital of Chinese PLA,Sanya 572013, Hainan,CHINA

ObjectiveTo construct a new biodegradable ureteral scaffold material as drug carrier,and investigate its degradation characteristics,drug-release property and histocompatibility.MethodsTwo different sizes of ureteral scaffold material for drug carrier were fabricated with polycaprolactone(PCL)/poly(lactic acid-glycolic acid) (PLGA)and rapamycin.General observation and Scanning Electron Microscope(SEM)were performed to investigate the biodegradation characteristics of scaffold materials after 0,2,4,6,8 and 10 weeks of constant temperature shaking. Meanwhile,scaffold materials were detected by high-performance liquid chromatography(HPLC)to investigate the drug release property.The scaffold materials were implanted in the dorsal muscle of 6 rabbits,and histocompatibility was assessed by histology and image analysis system after 1,4 and 12 weeks.ResultsAfter being dipped in human urine for 4 weeks,a few of floaters could be seen in all centrifuge tube and weight of scaffold materials were decreased by 27%. Under the SEM,small holes were found on the surface of scaffold materials.The drug loading dosage of the scaffolds were gradually decreased,and there were statistically significant differences between every two groups[2 weeks group and 4 weeks group of(1 335±74)μg vs(1 165±84)μg,4 weeks group and 6 weeks group of(1 165±84)μg vs(622±25)μg, 6 weeks group and 8 weeks group of(622±25)μg vs(286±17)μg,P＜0.01],but not between 0 week group and 2 weeks group[(1 412±28)μg vs(1 335±74)μg,P＞0.05].The results of histology showed mild acute inflammatory reaction,and fibroustissue hyperplasia was proliferated slightly.ConclusionThis drug-loading ureteral scaffold material gets along well with body tissues,and the drug is sustainedly released in vitro over 8 weeks.

Ureter scaffold;Drug carrier;Degradation;Drug-release;Histocompatibility

R693

A

1003—6350（2016）07—1033—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.001

2015-11-29)

北京市自然科學基金(編號：7142145)；海南省自然科學基金(編號：20158299)；海南省醫(yī)藥衛(wèi)生重點科研項目(編號：14A110062)；教育部留學回國人員科研啟動基金

符偉軍。E-mail:fuweijun@hotmail.com