王心淼,郜青葉,金子夜，馬大光，焦雪琴，狄旭

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科，呼和浩特 010020)

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·論著·

糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞的Fas、P53基因表達

王心淼,郜青葉,金子夜，馬大光，焦雪琴，狄旭

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科，呼和浩特 010020)

[摘要]目的探討糖尿病性白內(nèi)障及老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞(LEC)的凋亡與Fas、P53基因的關(guān)系。方法在白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)中取糖尿病性及老年性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜標(biāo)本45例，應(yīng)用光鏡，電鏡觀察LEC的凋亡情況，應(yīng)用RT-PCR定量檢測Fas蛋白，P53蛋白在白內(nèi)障LEC中的表達。結(jié)果兩種白內(nèi)障LEC中均有Fas，P53蛋白表達。Fas蛋白在糖尿病性白內(nèi)障LEC中的表達平均是老年性白內(nèi)障的13.34倍，P53蛋白在糖尿病性白內(nèi)障LEC中的表達平均是老年性白內(nèi)障的7.3倍，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論兩種白內(nèi)障LEC均出現(xiàn)凋亡，F(xiàn)as、P53基因在糖尿病性白內(nèi)障LEC凋亡中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]糖尿病并發(fā)癥/白內(nèi)障 ；上皮細胞/晶體；凋亡誘導(dǎo)因子；基因,p53

晶狀體上皮細胞(LEC)是晶狀體前囊膜的單層上皮細胞,是晶狀體內(nèi)代謝最活躍的部位,擔(dān)負著晶狀體的生長、分化及損傷修復(fù),在保護整個晶狀體的透明性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起著重要作用[1-3]。Li等[4-6]于1995 年提出晶體細胞凋亡是非先天性白內(nèi)障的共同基礎(chǔ)。一旦由于某些原因，如氧化作用、紫外線照射、Ca2+增高、血糖增高等因素損害了晶狀體上皮細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，就可能導(dǎo)致晶狀體上皮細胞凋亡。我們對糖尿病性白內(nèi)障晶體上皮細胞光鏡及電鏡的微觀研究及Fas、P53基因蛋白方面研究，從分子生物學(xué)角度研究糖尿病性白內(nèi)障的防病機制。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2012年5月至2014年5月在我院行白內(nèi)障超乳手術(shù)的白內(nèi)障患者43例(45眼)，其中糖尿病患者22例(23眼)，年齡53～85歲，平均年齡(70.0±4.3)歲，糖尿病病史5年以上(合并視網(wǎng)膜增殖性病變3例)大于白內(nèi)障病史。入院前內(nèi)科已確診為2型糖尿病，術(shù)前空腹血糖控制在8.3 mmol/L以下，尿糖轉(zhuǎn)陰。老年性白內(nèi)障21例(22眼)，年齡55～82歲，平均年齡(68.5±2.7)歲，排除其他眼疾引起白內(nèi)障的因素，白內(nèi)障術(shù)前診斷標(biāo)準(zhǔn)：視力小于0.4(裸眼、矯正)，晶狀體混濁(核2～4級)，在“超乳”手術(shù)中由同一位術(shù)者完成連續(xù)環(huán)形撕囊取得中央部晶狀體前囊膜標(biāo)本，直徑>5 mm。將糖尿病性和老年性白內(nèi)障患者的晶體前囊膜標(biāo)本各5例做RT-PCR監(jiān)測，其余樣本做光鏡及電鏡檢測。

1.2方法

1.2.1光鏡標(biāo)本制作取下晶狀體前囊膜標(biāo)本，緩沖液沖洗干凈，平鋪于載玻片，濾紙吸除水分，干燥5 min，10%中性甲醛固定1 h，蘇木素伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2電鏡儀器 H-700H日本日立透射電子顯微鏡。

1.2.3 RT-PCR定量檢測主要儀器及試劑：渦旋振蕩儀QL-902，離心機Centrifuge 5415D，分光光度計NANODROP 2000，熒光定量PCR儀ABI7500。TRNzol總RNA提取試劑，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus),ROX plus，DL2,000 DNA Marker，引物合成。

把晶狀體前囊膜標(biāo)本放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨，待組織樣本呈粉狀后加入Trizol總RNA提取試劑保存5 min加氯仿0.2 mL，用力震蕩，離心管充分混勻，室溫下放置5～10 min，用Trizol法提取總RNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，然后采用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，將各樣品cDNA十倍稀釋后取2 μL做模板分別用于目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴充，同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析，取5 mL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠自動成像儀保存圖像并定量分析，根據(jù)Real Time PCR原始檢測結(jié)果按照2-△△Ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果即其他各樣品相對于對照樣品的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

2結(jié)果

2.1光鏡和電鏡下顯示光鏡下觀察糖尿病性白內(nèi)障部分LEC呈透明樣變性細胞顏色變淡，細胞內(nèi)可見空泡，細胞密度較老年性白內(nèi)障明顯下降，同Struck等[7]結(jié)果一致，凋亡細胞、變性細胞較老年性明顯增多。電鏡下兩種白內(nèi)障患者LEC細胞形態(tài)大小不一，以扁平狀為主，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性，核固縮，胞漿濃縮，核膜皺褶呈不規(guī)則形，染色質(zhì)分布不均勻，凋亡細胞與晶體囊膜結(jié)合疏松，有部分脫離。糖尿病性白內(nèi)障LEC中可見凋亡小體，白內(nèi)障LEC中未見到凋亡小體，糖尿病性LEC凋亡情況比老年性白內(nèi)障更為嚴(yán)重。

2.2各樣品RealTimePCR檢測結(jié)果及分析計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。

表1　Real Time PCR檢測相對定量結(jié)果

注：以糖樣本為對照樣本

3討論

本實驗電鏡下觀察到凋亡細胞體積縮小變形大多呈扁平狀，與晶體囊膜脫離，與周圍細胞間隙增大，線粒體腫大，細胞密度增加，核質(zhì)濃縮，染色質(zhì)分布不均，可見凋亡小體。糖尿病性白內(nèi)障LEC細胞凋亡情況比老年性更為嚴(yán)重。

Fas、p53蛋白在促進白內(nèi)障晶體上皮細胞凋亡中起重要作用，目前LEC導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生已是人們關(guān)注的熱點，但從客觀上來說，對細胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認識還不夠全面，比較清楚的通路有細胞凋亡的膜受體通路，細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)通路。Fas是一種跨膜蛋白，與天然配對的Fasl結(jié)合，首先Fasl誘導(dǎo)受體三聚體化，然后再細胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，內(nèi)含帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD，它是死亡信號轉(zhuǎn)錄中的一個連接蛋白，由兩部分組成，C端(死亡結(jié)構(gòu)域即DD結(jié)構(gòu)域)和N端(DED，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)，DD結(jié)構(gòu)域負責(zé)和Fas分子胞內(nèi)段上的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，再以DED和Caspases8原域中的DED相互作用，聚合多個Caspases8分子，該分子隨由單鏈酶原轉(zhuǎn)化成有活性的單鏈蛋白Caspases，它作為酶原被激活后，可直接破壞細胞結(jié)構(gòu)。滅活或者下調(diào)與DNA修復(fù)相關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白，由于這些蛋白功能被抑制，使細胞的增值與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡[8]，國內(nèi)于永斌等[9]與國外Okamura等[10]比較了年齡相關(guān)性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn)在有增殖性視網(wǎng)膜病變 (DR)的囊膜樣本中，TUNEL陽性細胞的百分比明顯高于年齡相關(guān)性白內(nèi)障組。P53為腫瘤抑制基因，野生型p53對細胞凋亡具有激發(fā)作用,而突變型p53則有抑制細胞凋亡的作用。在正常組織中野生型p53蛋白表達水平很低,當(dāng)DNA損傷后,p53基因激活,p53蛋白增多,以終止細胞增生,使損傷DNA得以修復(fù),保持細胞基因組的完整性;如果DNA修復(fù)失敗,p53蛋白持續(xù)升高,便可引起細胞凋亡當(dāng) p53基因發(fā)生突變時 ,突變的 p53蛋白不能引起細胞增殖的停滯或凋亡 ,導(dǎo)致細胞生長失控 ,腫瘤發(fā)生[11-12]。如表1中RT-PCR檢測結(jié)果所示，F(xiàn)as蛋白與P53蛋白在兩種白內(nèi)障中均可檢測到，糖尿病性白內(nèi)障LEC中Fas蛋白相對定量平均是老年性白內(nèi)障LEC中的13.22倍，p53蛋白在糖尿病性白內(nèi)障LEC中的相對定量平均是老年性白內(nèi)障LEC中的7.3倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Fas與p53基因介導(dǎo)的細胞凋亡在白內(nèi)障的形成中起著重要作用，電鏡下也證實糖尿病性白內(nèi)障的凋亡情況比老年性白內(nèi)障更為嚴(yán)重。

由于糖尿病性白內(nèi)障形成的影響因素很多，本實驗結(jié)果提示我們糖尿病性白內(nèi)障LEC發(fā)生凋亡的過程中房水中血糖升高可能有促進Fas、P53蛋白介導(dǎo)細胞凋亡的因素，如果這一因素被發(fā)現(xiàn)，就可以抑制Fas、P53蛋白介導(dǎo)細胞凋亡，減少和預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)生。

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Diabetic cataracts cataract lens epithelial cell apoptosis and the expression of Fas,P53 geneWangXinmiao,GaoQinmiao,JinZiye，MaDaguang,JiaoXueqin,DiXu(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople’sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010020，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationship between lens epithelial cells (LEC) apoptosis of the diabetic cataract and senile cataract and Fas,P53 gene.MethodsAnterior lens capsules specimens 45 cases were took from diabetic and senile cataract patients in the cataract ultrasonic emulsification operation,using light and electron microscopic to observing apoptosis of LEC,and applying RT-PCR to detect quantitatively expression of Fas protein and Bax protein in cataract LEC.ResultsTwo kinds of cataract in the LEC had both protein expression of Fas and P53.Fas protein expression in diabetic cataract LEC was 13.34 times in senile cataract.P53 protein expression in diabetic cataract LEC was 7.3 times in senile cataract,there were significant differences (P<0.05).ConclusionFas and P53 genes may play an important role in cataract LEC apoptosis.

[Key words]Diabetes complications/cataract；Epithelial cells/lens,crystalline；Apoptosis inducing factor；Genes,p53

(收稿日期：2015-06-11)

Corresponding author:Jin Ziye,Email：jinziye1978@126.com

中圖分類號:R587.26

文獻標(biāo)識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.012

作者簡介：王心淼，主治醫(yī)師，Email: 1977king@163.com通信作者：金子夜，醫(yī)師，Email:jinziye1987@126.com

基金項目:內(nèi)蒙古科技廳2011年度自治區(qū)應(yīng)用研發(fā)資金計劃(20110501)