龔玉姣 張 晶 周 勇 楊智聰

（廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440）

布魯菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

龔玉姣 張 晶 周 勇 楊智聰

（廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440）

David Bruce在19世紀(jì)60年代首次確認(rèn)布魯菌（即布氏桿菌）是人畜共患病布魯菌病的致病菌。至今，布魯菌病仍困擾著多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的人和家畜，引起一系列畜牧業(yè)和公共健康方面的問題及經(jīng)濟(jì)損失[1]。布魯菌病累及多個(gè)系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)不典型，其診斷具有挑戰(zhàn)性。慢性布魯菌病及復(fù)雜布魯菌病如診斷不明則會(huì)產(chǎn)生高額的檢查費(fèi)用，因此檢驗(yàn)科工作人員需要了解并掌握布魯菌病的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。布魯菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要基于從臨床樣本中分離出布魯菌、標(biāo)準(zhǔn)微生物試管試驗(yàn)、抗布魯菌抗體血清學(xué)檢測(cè)以及布魯菌DNA的分子檢測(cè)。 本文對(duì)布魯菌的檢測(cè)方法及其最新進(jìn)展綜述如下。

1 布魯菌的分離與鑒定

布魯菌病的確診要求從血、骨髓或其他組織和體液中分離出病原菌。臨床樣本中布魯菌的菌量差別很大，因此布魯菌的分離高度依賴于疾病的發(fā)展階段（急性還是慢性）、抗生素的使用、臨床標(biāo)本是否取材得當(dāng)以及培養(yǎng)方法是否恰當(dāng)[2]。在起病前2周發(fā)熱階段獲得的標(biāo)本中分離出布魯菌的幾率較高；骨髓標(biāo)本培養(yǎng)比血培養(yǎng)要敏感而且培養(yǎng)時(shí)間較短。經(jīng)典的選擇培養(yǎng)基中含有萘啶酸和桿菌肽素，嚴(yán)重影響馬耳他布魯菌和豬布魯菌的生長(zhǎng)。因此，含有萬古霉素、黏菌素、制霉素、呋喃妥英和兩性霉素B的新型選擇培養(yǎng)基被推薦用于畜類標(biāo)本，然而目前沒有該培養(yǎng)基在人患布魯菌病中使用的研究報(bào)道[3]。

患者的血經(jīng)4 d左右的培養(yǎng)即可找到病原菌，使用自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)如BACTEC系統(tǒng)，檢測(cè)效率會(huì)更高。但是對(duì)于疑似病例，將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到至少4周，同時(shí)間斷傳代培養(yǎng)，才能更可靠地排除布魯菌感染。對(duì)于含菌量較少的標(biāo)本，可以采用快速培養(yǎng)法（shell vial culture）分離兼性厭氧的胞內(nèi)菌[4]。

對(duì)可疑菌落的早期快速判斷方法是玻片凝集試驗(yàn)，即將未經(jīng)稀釋的多價(jià)布魯菌抗血清與菌落的生理鹽水懸液混合并預(yù)判。布魯菌的種類和分型鑒定則需要測(cè)試是否需要CO2、是否產(chǎn)生H2S、尿素酶的活性、與單特異性血清是否凝集、在選擇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況以及噬菌體型。以上實(shí)驗(yàn)耗時(shí)且判讀結(jié)果因人而異，因而并不適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。作為替代的半自動(dòng)代謝分型系統(tǒng)（Micronaut）擁有93種不同的底物，既能減少手工作業(yè)時(shí)間，又能減少經(jīng)實(shí)驗(yàn)室獲得感染的幾率[5]。近些年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF）的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為臨床微生物檢驗(yàn)的強(qiáng)有力工具之一。與傳統(tǒng)方法相比，質(zhì)譜技術(shù)快速、精確且經(jīng)濟(jì)。采用質(zhì)譜的方法可以直接從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中鑒定布魯菌，但是細(xì)菌的鑒定需要大規(guī)模的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，而由于布魯菌傳染劑量較低、一旦致病則病程較為持久，有被用于生化武器的可能性，因此布魯菌被劃分為B類“選擇性生物恐怖主義物種”，這就使得針對(duì)布魯菌數(shù)據(jù)庫(kù)的建立受到極大限制[6]。

2 布魯菌病的血清學(xué)診斷

與細(xì)菌培養(yǎng)不同，布魯菌病的血清學(xué)試驗(yàn)快速、無害、更敏感，因此在臨床工作中被廣為采用。但血清學(xué)試驗(yàn)只能間接證明布魯菌的感染。一般認(rèn)為，凝集效價(jià)≥1:160或者在隨訪過程中抗體滴度升高4倍及以上則可判定為活動(dòng)性布魯菌感染。然而，患者痊愈后的數(shù)月甚至數(shù)年，抗體檢測(cè)依舊可以陽(yáng)性。截至目前，能夠用于血清學(xué)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)參考抗原還沒有找到，一是因?yàn)椴剪斁闹嗵牵↙PS）可與臨床上其他常見細(xì)菌如耶爾森菌、志賀菌、霍亂弧菌等產(chǎn)生交叉反應(yīng)，二是因?yàn)椴皇撬胁剪斁加邢嗤目乖煞帧?/p>

現(xiàn)階段，血清凝集試驗(yàn)（SAT）仍然被認(rèn)為是參考標(biāo)準(zhǔn)。缺點(diǎn)是耗時(shí)耗力。 虎紅試驗(yàn)（RBT）將試管改良為卡片、玻片或平板，將經(jīng)虎紅染色的牛布魯菌的抗原懸液與血清混合（pH=3.65），觀察凝集?；⒓t試驗(yàn)快速、簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)在于對(duì)于慢性布魯菌病的假陰性較高。經(jīng)典Coombs試驗(yàn)可以作為血清凝集試驗(yàn)的補(bǔ)充，該方法可以檢測(cè)非凝集抗體。在慢性布魯菌病以及復(fù)發(fā)布魯菌病的患者中，SAT結(jié)果可能為陰性或不確定，此時(shí)Coombs試驗(yàn)診斷價(jià)值很高。不過，SAT與Coombs試驗(yàn)均費(fèi)時(shí)費(fèi)力。鑒于此，一種基于全抗體檢測(cè)的免疫捕獲方法布魯菌捕獲(Brucellacapt)應(yīng)運(yùn)而生。該方法的抗體滴度提示感染狀況，與疾病的階段無關(guān)，且抗生素治療后抗體滴度可大幅度下降[7]。在非布魯菌病流行地區(qū)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）也是常規(guī)檢測(cè)手段之一，而且商用試劑盒可靠，結(jié)果與SAT保持高度一致[8]。盡管ELISA費(fèi)用較高，但耗時(shí)短，對(duì)于慢性布魯菌病的診斷敏感性更高。其缺點(diǎn)是，類風(fēng)濕因子存在時(shí)易引起假陽(yáng)性，IgG大量存在時(shí)檢測(cè)IgM易產(chǎn)生假陰性。有研究進(jìn)一步表明，血清膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）的ELISA檢測(cè)對(duì)于布魯菌病椎間盤炎具有提示作用[9]。另外，用ELISA間接測(cè)定通過重組外膜結(jié)構(gòu)蛋白Omp28和Omp31作為抗原刺激所產(chǎn)生的抗體，診斷布魯菌病的敏感性與特異性均不亞于SAT方法[10]。最近，血清學(xué)檢測(cè)與生物傳感器相結(jié)合產(chǎn)生了一個(gè)新型快速檢測(cè)方法—電化學(xué)微磁珠生物傳感器法(EMBIA)。該方法將布魯菌抗原與微磁珠結(jié)合，再與含有布魯菌抗體的血清孵育，通過8通道電極讀取電化學(xué)信號(hào)的改變并轉(zhuǎn)換到電子設(shè)備上。該方法可原位檢測(cè)，快速、敏感性特異性均較高[11]。

3 布魯菌病的分子診斷

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可用來檢測(cè)培養(yǎng)標(biāo)本和血清、全血、尿液、腦脊液、漿膜腔液體等臨床樣本中的布魯菌的DNA。由于樣本中菌量較少以及基質(zhì)成分中含有抑制物，直接測(cè)定樣本中的DNA難度極高。因此，準(zhǔn)備樣品過程中應(yīng)該盡量除去抑制物，同時(shí)富集DNA模板的濃度。PCR檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)很多，它不依賴于疾病的階段，敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血培養(yǎng)，比血清學(xué)檢測(cè)更特異。布魯菌DNA檢測(cè)陽(yáng)性可見于布魯菌病的急性感染期、慢性感染期以及既往有過布魯菌病感染的無癥狀人群。經(jīng)過抗生素成功治療的患者，在治療期間、隨訪期間甚至在治愈后的數(shù)年，其布魯菌DNA的檢測(cè)均可以出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果[12]。這個(gè)現(xiàn)象說明布魯菌可以在人體巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并長(zhǎng)期存在，也說明PCR的敏感性極高。而且實(shí)時(shí)定量（real time）PCR還可用來區(qū)分急、慢性感染[13]。3.1 經(jīng)典PCR 經(jīng)典PCR方法診斷布魯菌病，需要一對(duì)引物，用來擴(kuò)增布魯菌靶點(diǎn)基因組序列。引物可以基于表達(dá)16S核糖體RNA、外膜結(jié)構(gòu)蛋白（omp2a, omp2b）、牛布魯菌31kDa免疫原性蛋白（BCSP31）的序列，也可以是16S核糖體DNA與23S核糖體DNA之間的中間序列以及插入序列（IS711）[14]。經(jīng)典PCR方法簡(jiǎn)單高效，不過該方法的效率依賴于引物的特異性。有研究專門針對(duì)BCSP31、16S核糖體RNA等設(shè)計(jì)不同的引物來探究診斷的敏感性，發(fā)現(xiàn)不同的引物導(dǎo)致診斷的敏感性差別很大[15]。實(shí)際上，臨床常將采集的血樣用于經(jīng)典PCR方法檢測(cè)布魯菌病。其中有幾方面因素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，如高濃度的白細(xì)胞DNA和亞鐵血紅素。此外，人體基因組DNA的存在也會(huì)干擾外周血PCR檢測(cè)布魯菌DNA的敏感性。有學(xué)者認(rèn)為血清樣本優(yōu)于全血樣本，但也有學(xué)者傾向于使用血塊黃層及全血。此外，足夠的樣本量和高效的DNA提取方法也是經(jīng)典PCR檢測(cè)手段的關(guān)鍵[16]。

3.2 實(shí)時(shí)定量PCR 與經(jīng)典PCR不同，實(shí)時(shí)定量PCR是在PCR過程中監(jiān)測(cè)擴(kuò)增而不是在PCR結(jié)束之后。與經(jīng)典PCR方法相比，實(shí)時(shí)定量PCR可以計(jì)數(shù)每個(gè)血樣的核酸量，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的自動(dòng)化。隨著實(shí)時(shí)定量PCR儀器及試劑價(jià)格的下調(diào)，越來越多的患者可以通過此項(xiàng)技術(shù)來測(cè)量DNA拷貝數(shù)、mRNA表達(dá)水平等。最近，用實(shí)時(shí)定量PCR方法快速檢測(cè)布魯菌并進(jìn)行分類的方法已被研發(fā)出來。靶標(biāo)序列包括16S-23S內(nèi)部轉(zhuǎn)錄隔離區(qū)（ITS）和omp25、omp31、BCSP 31、IS711等基因[17]。實(shí)時(shí)定量PCR更加快速、敏感、特異，重復(fù)性高。除此之外，這項(xiàng)檢測(cè)方法容易標(biāo)準(zhǔn)化和降低實(shí)驗(yàn)室工作人員感染布魯菌病的風(fēng)險(xiǎn)。有外國(guó)學(xué)者利用基于LightCycler的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)血清樣本中的布魯菌DNA，發(fā)現(xiàn)敏感性為91.9%，而特異性高達(dá)95.4%。還有學(xué)者比較TaqMan實(shí)時(shí)PCR與傳統(tǒng)方法檢測(cè)布魯菌病患者處于不同階段時(shí)的血清樣本，敏感性為88%，特異性為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%，陰性預(yù)測(cè)值83%。研究人員探索多項(xiàng)檢測(cè)方法組合對(duì)布魯菌的診斷效力，認(rèn)為即便在凝集試驗(yàn)是陰性的情況下，實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA以及培養(yǎng)都可能提示有價(jià)值的信息[17]。通過設(shè)計(jì)一組引物，實(shí)時(shí)定量PCR還能用于分辨布魯菌的不同品種，還可能據(jù)此檢測(cè)到新的品種。當(dāng)然，就像經(jīng)典PCR一樣，實(shí)時(shí)定量PCR的效率也取決于引物的特異性。到目前為止，針對(duì)16S-23S內(nèi)部轉(zhuǎn)錄隔離區(qū)（ITS）以及IS711設(shè)計(jì)的引物最敏感、特異、高效。不過也有影響實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的因素，比如從血清樣本提取模板DNA時(shí)可能帶有的免疫球蛋白G，會(huì)影響實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增環(huán)節(jié)[18]。

3.3 多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是指基于PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增幾段不同的DNA序列，即在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立的PCR。該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)依賴于多對(duì)引物和溫度調(diào)節(jié)的DNA聚合酶。引物的設(shè)計(jì)需要滿足所有的引物在同一個(gè)退火溫度下都能夠工作。對(duì)于多重PCR而言，隨著反應(yīng)體系中引物的增多，引物二聚體形成的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)提高。因此引物設(shè)計(jì)優(yōu)化時(shí)還需考慮到非特異性PCR產(chǎn)物的問題。由于多重PCR能夠同時(shí)擴(kuò)增幾段序列，一次多重PCR檢測(cè)能夠獲得的信息是經(jīng)典PCR的幾倍，同時(shí)還能減少試劑的使用和縮短檢測(cè)時(shí)間。目前，多重PCR可以一次性檢測(cè)多種病原體。早在2003年，就有研究人員采用多重PCR的方法診斷布魯菌病。多重PCR方法除了可以診斷布魯菌病，還能幫助分型。在2007年，Imaoka等[19]通過設(shè)計(jì)4對(duì)引物（bcsp31、 omp2b、omp2a、omp31）在同一個(gè)反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)了布魯菌的4種主要類型。多重PCR檢測(cè)布魯菌耗時(shí)在1.5 h左右，結(jié)果回報(bào)及時(shí)、精確，有利于追蹤感染源以及快速診斷。近年來，有研究人員利用多重PCR技術(shù)來同時(shí)檢測(cè)布魯菌（IS711、bcsp31、omp2a基因）與結(jié)核分枝桿菌（IS6110、senX3-regX3、cfp31基因）。結(jié)果表明該技術(shù)切實(shí)可行，能夠?yàn)榉瓮饨Y(jié)核與復(fù)雜布魯菌病的鑒別診斷提供重要依據(jù)[20]。

3.4 巢式與半巢式PCR 巢式PCR是對(duì)經(jīng)典PCR技術(shù)的一種改良，其目的是減少非特異性片段的擴(kuò)增。經(jīng)典PCR要求引物從目標(biāo)序列的兩端進(jìn)行擴(kuò)增，然而引物有可能與其他位點(diǎn)結(jié)合從而擴(kuò)增出非特異性目標(biāo)產(chǎn)物。巢式PCR需要兩對(duì)引物。目標(biāo)DNA序列在第一對(duì)引物的參與下進(jìn)行第一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在引物可能隨機(jī)結(jié)合到非目標(biāo)序列的情況下會(huì)產(chǎn)生一系列擴(kuò)增產(chǎn)物，其中只有一個(gè)產(chǎn)物包含了終極目標(biāo)序列。在第2對(duì)引物的選擇下，只有真正含有終極目標(biāo)序列的首輪擴(kuò)增產(chǎn)物才能進(jìn)入第二輪擴(kuò)增，從而保證了最后的擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。與巢式PCR類似，半巢式PCR也有兩對(duì)引物，然而第2對(duì)引物中的一個(gè)引物與第1對(duì)引物中的一個(gè)引物非常相似。因此，巢式PCR與半巢式PCR都比經(jīng)典PCR特異。最近，巢式與半巢式PCR也被用來檢測(cè)血樣中的布魯菌。針對(duì)IS711、IS6501、bcsp31、VirB11基因的巢式與半巢式PCR技術(shù)檢測(cè)布魯菌已有文獻(xiàn)報(bào)道[21]。不過，巢式與半巢式PCR也有缺點(diǎn)，比如引物二聚體可能增多，另外，這兩種方法只能檢測(cè)出一組布魯菌而無法具體分型。

3.5 兩階段PCR 兩階段PCR是經(jīng)典PCR與多重PCR的結(jié)合。2013年Kamal等[22]首先針對(duì)bcsp31基因的223個(gè)堿基對(duì)序列進(jìn)行擴(kuò)增，該序列在各種致病型布魯菌中高度保守；針對(duì)致病型布魯菌的IS711序列設(shè)計(jì)不同的引物，確保每種類型布魯菌擴(kuò)增出來的DNA產(chǎn)物長(zhǎng)度不一從而用于區(qū)分布魯菌的類型；然后將第一階段的擴(kuò)增產(chǎn)物與多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR，此即第二階段PCR。該方法對(duì)于疫區(qū)的布魯菌病診斷及致病菌的分布有著很高的價(jià)值。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP） LAMP是一項(xiàng)十分精簡(jiǎn)的PCR技術(shù)，其所有擴(kuò)增及檢測(cè)都在等溫條件下一步完成。因此該項(xiàng)技術(shù)對(duì)設(shè)備的要求不高，適合于發(fā)展中國(guó)家實(shí)驗(yàn)室使用。LAMP方法能夠在等溫條件下完成有賴于源自枯草芽孢桿菌的DNA聚合酶活性。當(dāng)PCR反應(yīng)體系中存在4種靶向特異的引物時(shí)，該酶能夠催化在單一溫度條件下大量擴(kuò)增模板DNA序列的一個(gè)特異性片段。反應(yīng)產(chǎn)物的量遠(yuǎn)大于同等條件下的經(jīng)典PCR。如此高效的擴(kuò)增使得反應(yīng)產(chǎn)物可以采用比色法來直接檢查分析[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)bcsp31設(shè)計(jì)引物采用LAMP檢測(cè)布魯菌，其敏感性與經(jīng)典PCR類似，耗時(shí)2～3 h，由于所有反應(yīng)均在同一溫度下完成，因此實(shí)驗(yàn)室配備的水浴鍋即可替代經(jīng)典PCR儀進(jìn)而節(jié)約成本[24]。

現(xiàn)階段，PCR檢測(cè)布魯菌可以作為其他臨床檢測(cè)的重要補(bǔ)充，而且還有報(bào)道指出PCR快速檢測(cè)布魯菌DNA有助于布魯菌病處于窗口期時(shí)期（從臨床起病到血清學(xué)轉(zhuǎn)陽(yáng)之間的時(shí)期）的診斷，窗口期時(shí)DNA陽(yáng)性而凝集試驗(yàn)陰性的患者在3個(gè)月后復(fù)查80%的患者凝集實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)為陽(yáng)性[25]。不過PCR技術(shù)成本依然較高，同時(shí)質(zhì)控難以標(biāo)準(zhǔn)化，因此PCR技術(shù)仍需不斷優(yōu)化、服務(wù)臨床。如前所述，PCR檢測(cè)到的DNA可來源于急性感染期，也可來源于吞噬細(xì)胞中的布魯菌，甚至可來源于已經(jīng)死亡的細(xì)胞，因此臨床上PCR結(jié)果的判讀需要結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)以及其他實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果。

4 總結(jié)與展望

布魯菌病的許多方面諸如臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特點(diǎn)、致病機(jī)制、診斷技術(shù)、治療方式等多年以來已取得了較大進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方面，細(xì)菌的分離培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)、DNA檢測(cè)已成為三大支柱。今后亟待解決的問題是：①研發(fā)特異的血清學(xué)診斷標(biāo)記物和預(yù)后標(biāo)記物；②研究布魯菌病不同疾病進(jìn)程（急性、慢性、復(fù)發(fā)、治愈）的抗原表達(dá)成分從而提示疾病的進(jìn)程；③研發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的PCR相關(guān)的分子檢測(cè)流程及設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化的核酸探針。

［1］Pappas G, Papadimitriou P, Akritidis N, Christou L, Tsianos EV. The new global map of human brucellosis[J]. Lancet Infect dis，2006， 6(2): 91-99 .DOI: 10.1016/s1473-3099(06)70382-6.

［2］Al Dahouk S, Tomaso H, Nockler K, Neubauer H, Frangoulidis D. Laboratory-based diagnosis of brucellosis--a review of the literature. (Part I): techniques for direct detection and identification of Brucella spp[J]. Clin Lab, 2003, 49(9-10): 487-505.

［3］De Miguel MJ, Marin CM, Munoz PM, Dieste L, Grillo MJ, Blasco JM. Development of a selective culture medium for primary isolation of the main Brucella species[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(4): 1458-1463. DOI: 10.1128/jcm.02301-10.

［4］Rovery C, Rolain JM, Raoult D, Brouqui P. Shell vial culture as a tool for isolation of Brucella melitensis in chronic hepatic abscess[J]. J Clin Microbiol,2003, 41(9): 4460-4461.

［5］Al Dahouk S, Scholz HC, Tomaso H, Bahn P, Gollner C, Karges W, Appel B, Hensel A, Neubauer H, Nockler K. Differential phenotyping of Brucella species using a newly developed semiautomated metabolic system[J]. BMC Microbiol, 2010, 10: 269. DOI: 10.1186/1471-2180-10-269.

［6］Lista F, Reubsaet FA, De Santis R, Parchen RR, de Jong AL, Kieboom J, van der Laaken AL, Voskamp-Visser IA, Fillo S, Jansen HJ, Van der Plas J, Paauw A. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS[J]. BMC Microbiol, 2011, 11: 267.DOI: 10.1186/1471-2180-11-267.

［7］Mantur BG, Amarnath SK, Parande AM, Patil GA, Walvekar RR, Desai AS, Parande MV, Shinde RS, Chandrashekar MR, Patil SD, Shivaram C, Salagare RC. Comparison of a novel immunocapture assay with standard serological methods in the diagnosis of brucellosis[J]. Clin Lab,2011, 57(5-6): 333-341.

［8］Prince HE, Lopez J, Yeh C, Tablante J, Morgan J, Kaneko B, Duffey P. Performance characteristics of the Euroimmun enzymelinked immunosorbent assay kits for Brucella IgG and IgM[J]. Diagnostic Microbiol Infect Dis,2009, 65(2): 99-102.DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.06.002.

［9］Aktug Demir N, Kolgelier S, Sumer S, Inkaya AC, Ozcimen S, Demir LS, Ural O, Arpaci A. Serum annexin A2 levels in acute brucellosis and brucellar spondylodiscitis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(10): 1855-1859. DOI: 10.1007/s10096-014-2155-2.

［10］Tiwari S, Kumar A, Thavaselvam D, Mangalgi S, Rathod V, Prakash A, Barua A, Arora S, Sathyaseelan K. Development and comparative evaluation of a plate enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant outer membrane antigens Omp28 and Omp31 for diagnosis of human brucellosis[J]. Clin Vaccine Immunol: CVI,2013, 20(8): 1217-1222. DOI: 10.1128/ cvi.00111-13.

［11］Cortina ME, Melli LJ, Roberti M, Mass M, Longinotti G, Tropea S, Lloret P, Serantes DA, Salomon F, Lloret M, CaillavaAJ, Restuccia S, Altcheh J, Buscaglia CA, Malatto L, Ugalde JE, Fraigi L, Moina C, Ybarra G, Ciocchini AE, Comerci DJ. Electrochemical magnetic microbeads-based biosensor for point-of-care serodiagnosis of infectious diseases[J]. Biosens Bioelectr,2016, 80: 24-33. DOI: 10.1016/j.bios.2016.01.021.

［12］Vrioni G, Pappas G, Priavali E, Gartzonika C, Levidiotou S. An eternal microbe: Brucella DNA load persists for years after clinical cure[J]. Clin Infect Dis,2008, 46(12): e131-136. DOI: 10.1086/588482.

［13］Queipo-Ortuno MI, Colmenero JD, Bravo MJ, Garcia-Ordonez MA, Morata P. Usefulness of a quantitative real-time PCR assay using serum samples to discriminate between inactive, serologically positive and active human brucellosis[J]. Clin Microbiol Infect,2008, 14(12): 1128-1134. DOI: 10.1111/ j.1469-0691.2008.02095.x.

［14］Wang Y, Wang Z, Zhang Y, Bai L, Zhao Y, Liu C, Ma A, Yu H. Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis[J]. An Clin Microbiol Antimicrob,2014, 13: 31.DOI: 10.1186/s12941-014-0031-7.

［15］Baddour MM, Alkhalifa DH. Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection of Brucella DNA in peripheral human blood[J]. Can J Microbiol, 2008, 54(5): 352-357. DOI: 10.1139/w08-017.

［16］Gemechu MY, Gill JP, Arora AK, Ghatak S, Singh DK. Polymerase chain reaction (PCR) assay for rapid diagnosis and its role in prevention of human brucellosis in Punjab, India[J]. Intern J Preventive Med,2011, 2(3): 170-177.

［17］Zhang B, Wear DJ, Stojadinovic A, Izadjoo M. Sequential realtime PCR assays applied to identification of genomic signatures in formalin-fixed paraffin-embedded tissues: a case report about brucella-induced osteomyelitis[J]. Military Med,2013, 178(1): 88-94.

［18］Queipo-Ortuno MI, De Dios Colmenero J, Macias M, Bravo MJ, Morata P. Preparation of bacterial DNA template by boiling and effect of immunoglobulin G as an inhibitor in real-time PCR for serum samples from patients with brucellosis[J]. Clin Vaccine Immunol: CVI,2008, 15(2): 293-296. DOI: 10.1128/cvi.00270-07.

［19］Imaoka K, Kimura M, Suzuki M, Kamiyama T, Yamada A. Simultaneous detection of the genus Brucella by combinatorial PCR[J]. Jap J Infect Dis,2007, 60(2-3): 137-139.

［20］Sanjuan-Jimenez R, Colmenero JD, Bermudez P, Alonso A, Morata P. Amplicon DNA melting analysis for the simultaneous detection of Brucella spp and Mycobacterium tuberculosis complex. Potential use in rapid differential diagnosis between extrapulmonary tuberculosis and focal complications of brucellosis[J]. PloS one,2013, 8(3): e58353. DOI: 10.1371/ journal.pone.0058353.

［21］Lin GZ, Zheng FY, Zhou JZ, Gong XW, Wang GH, Cao XA, Qiu CQ. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the omp25 gene for rapid detection of Brucella spp[J]. Molecular Cellular Probes,2011, 25(2-3): 126-129. DOI: 10.1016/j.mcp.2011.01.001.

［22］Kamal IH, Al Gashgari B, Moselhy SS, Kumosani TA, Abulnaja KO. Two-stage PCR assay for detection of human brucellosis in endemic areas[J]. BMC Infect Dis, 2013, 13: 145. DOI: 10.1186/1471-2334-13-145.

［23］Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J]. Bio Techniques,2009, 46(3): 167-172. DOI: 10.2144/000113072.

［24］Trangoni MD, Gioffré AK, Cerón Cucchi ME, Caimi KC, Ruybal P, Zumárraga MJ, Cravero SL. LAMP technology: Rapid identification of Brucella and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis[J]. Brazil J Microbiol, 2015, 46(2): 619-626. DOI: 10.1590/S1517-838246220131206.

［25］Chen Z, Wang Y, Wang Z, Ke Y, Zhen Q, Yuan X, Zhang W, Lu Y, Yu Y, Song H, Huang L. Improvement and advancement of early diagnosis of human brucellosis in window period[J]. Clin Infect Dis, 2013, 57(2): 322-323. DOI: 10.1093/cid/cit198.

2016-04-18)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 021

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（B2016101）

楊智聰（E-mail:gdgzcdc@21cn.com）