高玉雷 翟建華 劉 斌 柴艷芬

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300052）

阿爾茨海默病患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞穩(wěn)定性的分析

高玉雷 翟建華 劉 斌 柴艷芬

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300052）

目的：探討阿爾茨海默病(AD)患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)穩(wěn)定性的特點。方法：分選AD患者外周血Tregs，通過流式細(xì)胞儀檢測特征性標(biāo)志物叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Foxp)-3和表面分子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)-4 及膜相關(guān)轉(zhuǎn)化性生長因子(TGF)-β的表達(dá)水平，通過ELISA檢測特征性細(xì)胞因子TGF-β和白細(xì)胞介素(IL)-10分泌水平，并進(jìn)一步通過Transwell培養(yǎng)板培養(yǎng)方法，分析AD患者Tregs發(fā)揮免疫抑制功能的特點。結(jié)果：與對照組比較，AD組患者細(xì)微精神狀態(tài)語言檢查(MMSE)評分明顯降低(P＜0.01)；AD組外周血Tregs數(shù)目、特征性標(biāo)志物Foxp-3及細(xì)胞表面標(biāo)志物CTLA-4和膜相關(guān)TGF-β表達(dá)水平均均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；特征性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10分泌水平均無明顯變化(P＞0.05)；經(jīng)Transwell培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，能夠降低AD組Tregs對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖功能的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：AD能夠降低患者外周血Tregs穩(wěn)定性，其機(jī)制主要是降低其以細(xì)胞接觸途徑介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用。

阿爾茨海默病 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 免疫抑制 穩(wěn)定性

阿爾茨海默?。ˋD)主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)β淀粉樣變性，慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)是病情發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制[1]。既往有研究表明，高齡AD晚期患者外周血主要表現(xiàn)為β淀粉樣變性特異性T細(xì)胞比例升高[2]。近期通過5XFAD小鼠AD模型研究發(fā)現(xiàn)，這種特異性T細(xì)胞比例的升高與Foxp-3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）比例及穩(wěn)定性降低有關(guān)，增加小鼠體內(nèi)Tregs比例能夠降低神經(jīng)系統(tǒng)β淀粉樣變性的程度以及延緩變性時間，但目前并沒有針對AD患者外周血Tregs特點的

探討[3]。本研究通過檢測AD患者外周血Tregs特征性標(biāo)志物叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor, Foxp)-3和表面分子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(cytotoxic T lymphocyte associated antigen, CTLA)-4及膜相關(guān)轉(zhuǎn)化性生長因子(transforming growth factor, TGF)-β表達(dá)水平，檢測細(xì)胞因子TGF-β和IL-10分泌水平，并進(jìn)一步通過Transwell培養(yǎng)板培養(yǎng)方法，初步探討AD患者外周血Tregs穩(wěn)定性的特點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器 人CD4+CD25+Tregs分選試劑盒(德國Miltenyi公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，RPMI1640培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶公司)，紅細(xì)胞裂解液(天津灝洋生物公司)，人IL-10和TGF-β ELISA試劑盒(上海依科賽公司)，細(xì)胞毒性/增殖檢測試劑-8(日本Dojindo公司)，異硫氰酸熒光素（FITC）-人-Foxp-3、FITC-人-CTLA-4和APC-人-TGF-β (加拿大eBioscience公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本NAPC公司)，光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，SpectraMR多功能酶標(biāo)儀(美國DYNEX公司)，細(xì)胞分選儀和流式細(xì)胞儀(德國Miltenyi公司)。

1.2 研究對象 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2015年1月—2016年1月收治的AD患者（AD組）及無AD表現(xiàn)的患者（對照組）。AD依據(jù)美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所AD及相關(guān)疾病協(xié)會制定的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行診斷，并采用細(xì)微精神狀態(tài)語言檢查(mini-mental state examination, MMSE)量表[5]進(jìn)行癡呆評分篩選；對照組采用MMSE量表對能夠生活自理的患者進(jìn)行記憶力和智力測定等評分，排除癡呆等AD臨床表現(xiàn)。所有研究對象均通過結(jié)合詢問病史、常規(guī)體格檢查及近期相關(guān)輔助檢查等，排除免疫相關(guān)疾病及近期服用影響免疫功能藥物的患者。對兩組研究對象的年齡和性別等因素進(jìn)行分析，保證研究資料的一致性。本試驗均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞分離及培養(yǎng) 分別抽取各組患者外周血40 ml，使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞。按照磁珠分選原理分選人 CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞純度分別約為 96% 和95%，錐蟲藍(lán)染色細(xì)胞存活率均超過96%，可以進(jìn)行試驗。以抗-人-CD3/CD28為CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的刺激因子，使用96孔普通培養(yǎng)板和Transwell培養(yǎng)板，CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞比例為1∶1共培養(yǎng)24 h。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 流式細(xì)胞儀檢測Tregs標(biāo)志物表達(dá) 收集分選后的各組Tregs，離心棄上清液，加入100 μl磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞(2×105)，分別加入FITC-人-Foxp-3、FITC-人-CTLA-4和APC-人-TGF-β，設(shè)陰性對照管；4 ℃避光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液 2～3 ml離心洗滌2次，棄上清液；重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)率。

1.4.2 多功能酶標(biāo)儀檢測CD4+CD25-T細(xì)胞增殖能力 各組Tregs 和 CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，各孔吸出 100 μl上清液，并加入10 μl細(xì)胞毒性/增殖檢測試劑-8，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，通過多功能酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處的吸光度值(A450)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件處理各組數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組與AD組一般資料分析 兩組研究對象的樣本數(shù)目、性別及年齡分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。按照MMSE評分進(jìn)行癡呆篩查后，AD組評分[(12.321±1.210)分]明顯低于對照組[(24.654±1.543)分]，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 對照組與AD組一般資料分析

2.2 對照組與AD組外周血Tregs數(shù)目與標(biāo)志物的特點 AD組外周血Tregs數(shù)目[(1.321±0.231)×105/ml]明顯低于對照組[(2.300±0.435)×105/ml]，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與對照組比較，AD患者外周血Tregs特征性標(biāo)志物Foxp-3[對照組(77.430±4.543)%比AD組(55.654±2.654)%]及細(xì)胞表面標(biāo)志物CTLA-4[對照組(70.543±5.881)%比AD組(51.430±3.439)%]和膜相關(guān)TGF-β[對照組(57.057±4.697)%比AD組(47.597±3.836)%]表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見圖1。

圖1 AD對患者外周血Tregs數(shù)目(A)與標(biāo)志物Foxp-3(B)、CTLA-4（C）和膜相關(guān)TGF-β(D)的影響

2.3 對照組與AD組外周血Tregs分泌游離細(xì)胞因子的特點 分選各組外周血Tregs，體外培養(yǎng)2 4 h后，T r e g s分泌T G F-β的水平[對照組(116.187±14.995)pg/ml比AD組(120.110±11.977)pg/ml]和IL-10的水平[對照組(91.283±8.448)pg/ml比AD組(87.120±13.613) pg/ml]差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)。見圖2。

圖2 AD對患者外周血Tregs分泌游離細(xì)胞因子TGF-β（A）和IL-10（B）的影響

2.4 對照組與AD組外周血Tregs免疫抑制功能的特點 分選各組外周血Tregs，分別使用普通培養(yǎng)板和Transwell培養(yǎng)板，體外按照細(xì)胞數(shù)為1:1的比例與正常CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，與單純培養(yǎng)的正常CD4+CD25-T細(xì)胞組(A組，0.717±0.088)比較，其余各組Tregs均能抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖功能(B組0.303±0.081, C組0.603±0.032, D組0.513±0.057和E組0.612±0.054)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；經(jīng)普通培養(yǎng)板培養(yǎng)后，AD組患者分選的Tregs對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖功能的抑制作用（D組）明顯弱于對照組患者（B組），差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；經(jīng)Transwell培養(yǎng)板培養(yǎng)后，能夠進(jìn)一步降低AD患者外周血Tregs對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖功能的抑制作用（E組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05和(P＜0.01)。見圖3。

圖3 AD對患者外周血Tregs免疫抑制功能的影響

3 討 論

大量研究表明，過度的特異性T細(xì)胞活化和功能增強(qiáng)所引起的神經(jīng)系統(tǒng)β淀粉樣變性參與AD的發(fā)生發(fā)展過程，并且與年齡有明顯的相關(guān)性[1-2]。研究者普遍認(rèn)為，過度的自身免疫反應(yīng)能夠加重AD的病情，甚至使AD的發(fā)生趨于年輕化，給予免疫調(diào)節(jié)治療，降低過度的特異性T細(xì)胞活化與功能增強(qiáng)能夠緩解AD癥狀以及預(yù)防AD的發(fā)生[6]。

CD4+CD25+Tregs 以高表達(dá)CD25及特征性標(biāo)志物Foxp-3 為主要特征，具有免疫無反應(yīng)性和免疫抑制性。根據(jù)來源不同，Tregs主要分為胸腺中發(fā)育的自然性Tregs(nTregs) 和抗原誘導(dǎo)外周CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的誘導(dǎo)性Treg(iTregs)，后者包括Tregs1/輔助性T細(xì)胞3(Tregs1/Th3)，狹義上Tregs指nTregs。盡管CD4+CD25+Tregs在CD4+T淋巴細(xì)胞中比例為5%～10%，但其在自身免疫性疾病、嚴(yán)重感染及惡性腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制中扮演著關(guān)鍵性角色[7-9]。

既往研究表明，在AD小鼠模型腦內(nèi)過表達(dá)Tregs膜相關(guān)TGF-β可以顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對β淀粉樣變性的清除，同時能夠緩解特異性T細(xì)胞過度活化所引起的神經(jīng)系統(tǒng)β淀粉樣變性[10]。對多發(fā)性硬化患者的研究表明，增加外周Tregs分泌TGF-β和IL-10的水平，能夠緩解病情的發(fā)展，然而對于具有類似發(fā)病機(jī)制的AD患者的相關(guān)研究中，尚未見相關(guān)報道[11]。本研究表明，AD組外周血Tregs數(shù)目、特征性標(biāo)志物Foxp-3及細(xì)胞表面標(biāo)志物CTLA-4和膜相關(guān)TGF-β表達(dá)水平均均降低，而特征性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10分泌水平均無明顯變化。本研究通過對AD患者外周血Tregs變化特點的分析，進(jìn)一步驗證了動物實驗的結(jié)果，為AD免疫調(diào)節(jié)治療提供了有力的依據(jù)，為探索AD免疫調(diào)節(jié)途徑提供了線索。

既往徐俊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血CD4+CD25+Tregs細(xì)胞比例及對T細(xì)胞免疫抑制功能明顯低于對照組，然而并未進(jìn)一步分析Tregs發(fā)生該變化的具體原因。Tregs主要通過CTLA-4和膜相關(guān)TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞接觸機(jī)制和分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，其對效應(yīng)性T細(xì)胞主要表現(xiàn)為，抑制T細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制促炎性細(xì)胞因子分泌等[7-9]。AD患者外周主要表現(xiàn)為過度的特異性T細(xì)胞活化與功能增強(qiáng)，IL-2和干擾素(IFN)-γ等促炎性細(xì)胞因子分泌增加，同時結(jié)合既往動物實驗表明特異性T細(xì)胞比例的升高與Foxp-3+Tregs比例及穩(wěn)定性降低有關(guān)，我們推測AD能夠降低患者外周血Tregs穩(wěn)定性[1-3]。我們進(jìn)一步的共培養(yǎng)結(jié)果也初步表明AD能夠降低患者Tregs對正常CD4+CD25-T細(xì)胞的免疫抑制作用，Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)一步表明，AD主要是降低了以CTLA-4和膜相關(guān)TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞接觸機(jī)制為主的免疫調(diào)節(jié)作用。

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Analysis of the stability of regulatory T cells in peripheral blood of patients with Alzheimer's disease

Gao Yulei*, Zhai Jianhua, Liu Bin, Chai Yanfen.
*Emergency Department, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Chai Yanfen (E-mail: chaiyanfen2012@126.com)

Objective: To investigate the stability of regulatory T cells (Tregs) in peripheral blood of patients with Alzheimer's disease (AD). Methods: The peripheral blood Tregs were isolated from AD patients. Flow cytometry was performed to detect the expressions of forkhead/winged helix transcription factor-3 (Foxp-3), the surface molecular cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4) and membrane associated transforming growth factor-β (TGF-β); ELISA was employed to determine the secretion levels of TGF-β and interleukin-10 (IL-10); and furthermore, Transwell culture plate was used to initially identify the immunosuppressive function of Tregs in AD patients. Results: Compared with the control group, the mini-mental state examination (MMSE) score of AD group was significantly lower (P＜0.01). The Tregs number, the expression levels of Foxp-3, CTLA-4 and membrane associated TGF-β were significantly lower in AD group than in control group (P＜ 0.05 or P＜0.01), but there were no obvious changes in the secretion levels of TGF-β and IL-10 (P＞0.05). The immunosuppressive function of Tregs to CD4+CD25- T cells was reduced in AD patients after Transwell culture for 24 hours (P＜0.05). Conclusions: AD can decrease the stability of Tregs in peripheral blood of patients, the mechanism might mainly be the decrease of immunoregulation mediated by cell contact pathway.

Alzheimer's disease; Regulatory T cells; Immunosuppression; Stability

2016-07-14)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 006

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院青年孵育基金 (ZYYFY2015020)；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)基金會“睿E（睿意）急診醫(yī)學(xué)研究專項基金”(201617)

柴艷芬，主任醫(yī)師（E-mail：chaiyanfen2012@126.com）