劉亞 明全

(1.宜昌市第三人民醫(yī)院醫(yī)保辦；2.宜昌市第三人民醫(yī)院肝病科，湖北 宜昌 443000)

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丙型肝炎病毒F蛋白缺失對(duì)病毒復(fù)制、致病及感染的影響分析

劉亞1明全2△

(1.宜昌市第三人民醫(yī)院醫(yī)保辦；2.宜昌市第三人民醫(yī)院肝病科，湖北 宜昌 443000)

目的 觀察丙型肝炎病毒F蛋白缺失對(duì)病毒復(fù)制、致病及感染的影響。方法 按生物化學(xué)的方法進(jìn)行，制備丙型肝炎病毒的RNA的轉(zhuǎn)錄體；根據(jù)培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理、記錄和分析。結(jié)果 引入突變基因的表達(dá)數(shù)與原基因表達(dá)數(shù)沒有顯著的差異且兩組核心蛋白的表達(dá)水平無顯著差異；F蛋白的表達(dá)在腫瘤組織中要高于其他組織，表明在肝癌的形成與F蛋白有一定的相關(guān)性；含有單一突變的核心蛋白與野生型的核心蛋白在結(jié)構(gòu)方面基本保持一致；F缺失型核心蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有了較多的變化。結(jié)論 HCVF蛋白的缺失對(duì)病毒的翻譯和復(fù)制的過程沒有影響，對(duì)病毒的翻譯、復(fù)制和治病性的影響加大的是核心蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

丙型肝炎病毒； 核心蛋白； 病毒復(fù)制； F蛋白

丙型肝炎病毒的感染是導(dǎo)致慢性肝臟疾病的罪魁禍?zhǔn)?，由此?dǎo)致的感染可進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化、脂肪肝和肝癌等重疾[1]。為進(jìn)一步了解丙型肝炎病毒F蛋白是如何影響病毒的感染、致病和復(fù)制的過程的，本研究觀察了在F蛋白缺失的情況下病毒翻譯和復(fù)制的過程，并對(duì)其缺失后核心蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是如何變化的做進(jìn)一步的分析

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 QuikChang LinghrningSite-Directed Mutagenesis Kit [Stratagene公司(美國)];異丙基硫代半乳糖苷、5-溴4-氯3-吲哚-β-D半乳糖苷、NZ胺、酵母提取物；14 mL BD Falcon 聚丙烯管(上海雅怡科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；HCV NS5A 單克隆抗體(Charles M .Rice教授)，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promrga 公司)；胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、Alex488羊抗鼠熒光、FITC-羊抗人IgG、Lipofectamine 2000、RNA抽提試劑(美國invitorgen公司)。

1.2 細(xì)胞株和質(zhì)粒構(gòu)建 以試劑盒的說明進(jìn)行定點(diǎn)突變引入試劑盒，以PFL-J6JFH1作為模版，引入突變的數(shù)量為5處，引入這些突變的目的在于終止已知的所有的F蛋白的復(fù)制，而這一過程并不改變HCV氨基酸的基因序列。

1.3 病毒RNA轉(zhuǎn)錄體制備 (1)線性化處理：通過XbaⅠ將質(zhì)粒進(jìn)行線性化的處理；(2)體外的轉(zhuǎn)錄：通過T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行；(3)純度和完整性檢測(cè)：試劑選擇體積比為25:1:24的苯酚、異戊醇和氯仿的混合液，然后用1.5%的瓊脂糖凝膠通過電泳對(duì)其純度和完整性進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng) RNA的轉(zhuǎn)錄體的轉(zhuǎn)染：選用1 000 g的胰酶消化細(xì)胞，依次經(jīng)過離心、分離、洗滌、重懸、稀釋、混勻和電擊(270 V、100 mΩ)等過程然后轉(zhuǎn)入恒濕恒溫箱(5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)。細(xì)胞的培養(yǎng)：Huh7.5.1細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置于5%CO2,37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液中添加L-谷氨酰胺 2 mmol/mL，NEAA 0.1 mmol/L，鏈霉素 100 g/mL及青霉素100 U/m。

1.5 對(duì)PCR進(jìn)行定量 將特異性引物引入HCV5`的非編碼區(qū)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，72 h后對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA或者是其上清RNA進(jìn)行抽提，定量檢測(cè)細(xì)胞中的HCVRNA；對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCV RNA的濃度進(jìn)行計(jì)算。

1.6 熒光觀察 將進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，首先接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，然后放入培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后(約48 h)棄去上清液；向每孔加入約100 μL的甲醇，在-20 ℃放的環(huán)境中靜置約20 min；進(jìn)行PBS洗滌，每次5 min，共3次；然后每孔中依次加入Triton X-100(100 μL，0.1%)、BSA、HCV患者血清(1∶100)、FITC-羊抗人(1∶100)或Alex488羊抗鼠熒光(1∶100)，然后進(jìn)行避光哺育(1 h)，最后有熒光顯微鏡進(jìn)行檢查并拍照。

1.7 病毒滴度檢測(cè) 對(duì)不同時(shí)間的轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞上清液進(jìn)行收集，取3 000 g左右進(jìn)行離心分離，以達(dá)到去除其中細(xì)胞碎片的目的，之后與-80 ℃的環(huán)境進(jìn)行保存。放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，最后進(jìn)行病毒滴度的檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和校對(duì)，計(jì)量資料和技術(shù)資料的比較分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分別選擇EXEL和SPSS16.0，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 引入突變基因與原基因表達(dá)數(shù)的比較分析 引入突變基因的表達(dá)數(shù)與原基因表達(dá)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩組核心蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 F蛋白缺失對(duì)病毒致病性的影響 F蛋白的表達(dá)在腫瘤組織中要高于其他組織，表明在肝癌的形成與F蛋白有一定的相關(guān)性。

2.3 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)病毒翻譯、復(fù)制過程及致病性的影響 含有單一突變的核心蛋白與野生型的核心蛋白在結(jié)構(gòu)方面基本保持一致；F缺失型核心蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有了較多的變化。

3 討 論

F蛋白是由HCV的核心的編碼序列經(jīng)過移碼編碼產(chǎn)生的，一般認(rèn)為編碼核心蛋白與編碼F蛋白的序列是相互重疊的。基因的內(nèi)部翻譯的起始位點(diǎn)被認(rèn)為是密碼子26[2-3]。Core+1/S蛋白(最短的F蛋白)的編碼區(qū)位是核心蛋白編碼區(qū)(85～87)的一段基因， 該區(qū)域被認(rèn)為是F蛋白的進(jìn)行內(nèi)部翻譯的起始位點(diǎn)[4]。目前為止，發(fā)現(xiàn)的移碼蛋白已有多種，但是對(duì)其生物功能的認(rèn)識(shí)還是十分的不清晰[5-6]。為了更深入的了解F蛋白的生物功能，明確其是如何影響HCV的復(fù)制、翻譯和致病過程的，該研究對(duì)野生型J6JFH1和自我構(gòu)建的突變體(J6JFH1/△F)進(jìn)行了對(duì)比和分析。結(jié)果顯示突變體HCV的RNA的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與之前相比降低了很多，與此同時(shí)，病毒的RNA的水平也下降明顯(下降近95%)，上清液中的病毒顆粒的數(shù)量也明顯減少[7]。將自我制備的突變體的RNA轉(zhuǎn)染到Huh7.5.1細(xì)胞上，對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的表達(dá)性進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)上清病毒RNA和病毒的滴度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，野生型和突變體之間無明顯差異[8]。由于引入突變可能引起HCV核心基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，而核心基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠?qū)CV RNA的復(fù)制和翻譯的過程造成影響；進(jìn)一步對(duì)核心基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，病毒的翻譯和復(fù)制的過程受到核心基因二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響，具體的過程有待進(jìn)一步的研究。

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