方超++白清博++王幸幸

摘 要：酶工程的研究現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到分子水平。通過(guò)基因工程、化學(xué)、物理等手段改造酶分子結(jié)構(gòu)與功能，大幅提高了酶分子的進(jìn)化效率和催化效率，生產(chǎn)有價(jià)值的非天然酶。本文對(duì)常見的酶分子的改造方法做了一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹，并對(duì)酶改造的發(fā)展前景做了描述。

關(guān)鍵詞：酶分子；基因工程；蛋白質(zhì)；前景

一、酶與酶的分子改造

（一） 酶

酶是指以蛋白質(zhì)為主體的生物催化劑，具有在常溫常壓和近中性pH等溫和條件下，高效率地進(jìn)行區(qū)域或?qū)τ丑w選擇性催化的特點(diǎn)。迄今為止，從生物界已發(fā)現(xiàn)和定性了近3000種酶，分屬氧化還原、轉(zhuǎn)移、水解、裂合、異構(gòu)、連接六大類。由于酶具有反應(yīng)專一性、催化效率高及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等方面已經(jīng)得到越來(lái)越多的應(yīng)用。但總體還沒(méi)有達(dá)到大規(guī)模應(yīng)用的程度，其主要原因在于酶自身性質(zhì)上的一些不足。因此，人們希望通過(guò)各種方法、按照需要定向地改造酶分子，甚至創(chuàng)造出自然界尚未發(fā)現(xiàn)的新酶，從而滿足各行各業(yè)的需要。

（二）酶的改造

在酶的應(yīng)用過(guò)程中，有時(shí)會(huì)因酶的穩(wěn)定性差、活力不夠理想及具有抗原性等缺點(diǎn)而受到一定的限制，為此常需對(duì)酶分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑旌图庸?，以改善酶的性能。酶分子的改造以提高酶的穩(wěn)定性和活性、增強(qiáng)酶的選擇性、改變酶的表面特性為目標(biāo).

二、改造酶的方法

（一） 化學(xué)修飾法

酶分子的化學(xué)修飾是指通過(guò)主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造，其目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的應(yīng)用以達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)效益。

酶在進(jìn)行化學(xué)修飾后，大多數(shù)酶的性質(zhì)會(huì)發(fā)生一些變化，如熱穩(wěn)定性、抗各類失活因子能力、抗原性、半衰期、最適PH值等。

酶修飾中存在的問(wèn)題是，隨著酶與修飾劑結(jié)合率提高，酶活回收率將下降?？朔姆椒ㄊ遣扇∫恍┍Ｗo(hù)措施，如添加酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，保護(hù)酶活性部位以及改進(jìn)現(xiàn)有的修飾工藝，進(jìn)一步完善酶的化學(xué)修飾法。

化學(xué)修飾酶的目標(biāo)是提高酶活力，改進(jìn)酶的穩(wěn)定性，改變酶的特異性，提高催化過(guò)程的反應(yīng)效率。

（二）生物酶工程法

酶的化學(xué)修飾法并非改造酶的惟一手段。隨著人們對(duì)酶的深入研究以及氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定、基因重組技術(shù)的應(yīng)用等，可以徹底地改造、合成并且模擬酶。這也就是生物酶工程的主要內(nèi)容。生物酶工程主要包括基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)。

1.基因工程技術(shù)改造和生產(chǎn)酶

基因工程改造酶分子主要包括三方面內(nèi)容：①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶。②修飾酶基因，產(chǎn)生遺傳修飾。③設(shè)計(jì)出新酶基因，合成自然界從未有過(guò)的酶。

自從 20 世紀(jì) 70 年代重組DNA技術(shù)的建立，使人們?cè)诤艽蟪潭壬蠑[脫了對(duì)天然酶的依賴。近十年來(lái)，基因工程的發(fā)展使得人們可以較容易地克隆各種各樣天然的酶基因，使其在微生物中高效表達(dá)，并通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行大量生產(chǎn)。目前已有100多種酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。

2.蛋白質(zhì)工程改造和生產(chǎn)酶

蛋白質(zhì)工程改造和生產(chǎn)酶包括合理設(shè)計(jì)技術(shù)和定向進(jìn)化技術(shù)。

合理設(shè)計(jì)技術(shù)是蛋白質(zhì)工程最早使用的技術(shù)，現(xiàn)在也在廣泛的使用。合理設(shè)計(jì)技術(shù)要做好三個(gè)方面的工作，首先要用結(jié)晶學(xué)技術(shù)來(lái)獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶體，然后利用x射線技術(shù)對(duì)晶體進(jìn)行測(cè)量、分析，確定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。其次，借助計(jì)算機(jī)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇修飾，從氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)見空間結(jié)構(gòu)，或通過(guò)人工智能等其它方法來(lái)確定蛋白質(zhì)和功能的關(guān)系，找到要修飾的位點(diǎn)。第三，通過(guò)對(duì)基因序列的了解，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)來(lái)進(jìn)行堿基替換。通過(guò)此法來(lái)改變蛋白質(zhì)的功能，要想獲得理想的蛋白質(zhì)工程產(chǎn)物往往要經(jīng)過(guò)多次分析，替換才能達(dá)到目的。

定向進(jìn)化技術(shù)是蛋白質(zhì)工程的新策略，它是在不需要事先了解蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的情況下通過(guò)模擬自然進(jìn)化機(jī)制，以改進(jìn)的誘變技術(shù)結(jié)合確定進(jìn)化方向的選擇方法。因此它能解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問(wèn)題，在生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。定向進(jìn)化是在待進(jìn)化蛋白質(zhì)基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向選擇方法，選出所需性質(zhì)的蛋白質(zhì)。定向進(jìn)化實(shí)際就是隨機(jī)突變加上選擇，它與自然進(jìn)化不同，整個(gè)過(guò)程都是在人為控制下進(jìn)行的，并且還可以模擬真核細(xì)胞中DNA隨機(jī)拼接這一蛋白質(zhì)進(jìn)化過(guò)程來(lái)加速蛋白質(zhì)的優(yōu)化。

酶的蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，而且仍需要應(yīng)用基因工程的全套技術(shù)。所不同的是，酶的基因工程主要解決的是酶大量生產(chǎn)的問(wèn)題，而蛋白質(zhì)工程則致力于天然蛋白質(zhì)的改造，制備各種定做的蛋白質(zhì)，但也要用到基因工程的技術(shù)手段。

（三）酶分子的定點(diǎn)突變法

定點(diǎn)突變需要知道酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)及編碼序列，并根據(jù)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)知識(shí)來(lái)設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)。定點(diǎn)突變技術(shù)可以隨心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定長(zhǎng)度的核苷酸片段。該方法與使用化學(xué)因素、自然因素導(dǎo)致突變的方法相比，具有突變率高、簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好的特點(diǎn)。然而，定點(diǎn)突變技術(shù)只能對(duì)天然酶蛋白中少數(shù)的氨基酸殘基進(jìn)行替換，酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)基本維持不變，因而對(duì)酶功能的改造較為有限。

三、酶分子改造展望

相對(duì)于其它各種功能蛋白質(zhì)，酶的結(jié)構(gòu)與功能研究還處于幼年期，如何對(duì)酶蛋白實(shí)施分子改造，使它們的性能得到改善，是具有挑戰(zhàn)性的課題。近年來(lái)，隨著抗體酶技術(shù)的發(fā)展，為酶分子設(shè)計(jì)提供了一個(gè)全新的思路。它打破了化學(xué)酶工程和生物酶工程的界限，結(jié)合了免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)等技術(shù)，制備出具有高度專一性及特殊催化活力的新型催化抗體。有資料顯示，隨著新生物工程技術(shù)和噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展，將有更先進(jìn)的重組技術(shù)用來(lái)直接從抗體庫(kù)中篩選催化抗體。