湯存麗

摘 要：本試驗利用該基因的電子克隆序列設(shè)計了一對引物，通過RT-PCR的方法對IRF6基因進(jìn)行克隆，并對擴增結(jié)果鑒定；以及檢測其在各組織中的分布情況。

關(guān)鍵詞：IRF6；克?。籖T-PCR；組織分布

IRF6基因由10個外顯子組成，第1、10外顯子及部分第9外顯子不翻譯；IRF6由467個氨基酸殘基組成。該基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子家族，這一家族由9個成員組成，他們的共同點是都由一個高度保守的螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋的DNA結(jié)合域和一個相對保守的蛋白質(zhì)結(jié)合域組成的。

大多數(shù)IRF基因在病毒感染后調(diào)節(jié)干擾素和8的表達(dá)，對IRF6的功能認(rèn)識相對落后.J.Knight等分析了小鼠和雞面部發(fā)育時的IRF6基因的表達(dá)，結(jié)果表明在面部融合形成上唇和原發(fā)顎的過程中均有該基因表達(dá)，證實了IRF6在唇顎部發(fā)育融合過程中起作用。Viera等的研究則認(rèn)為IRF6與牙齒發(fā)育不全關(guān)系密切。2006年，Ingraham等建立了IRF6基因敲除的小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因敲除的小鼠，其皮膚、四肢和面部均表現(xiàn)異常。組織學(xué)和基因表達(dá)分析表明，IRF6在調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞的增值和分化中起了很重要的作用，說明IRF家族在表皮發(fā)育過程中有新的功能。實驗結(jié)果的動物取材為--80℃冰箱保存的肚長大三元豬的各部位組織。取豬的肌肉組織用于目的基因克?。蝗∝i心、肝、脾、肺、腎、空腸、十二指腸、回腸、腦、肌肉、皮膚、脂肪、胸腺、淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、子宮、睪丸17種組織用于組織分布研究。

一、實驗結(jié)果與分析

（一）樣品中總RNA的檢測結(jié)果

樣品經(jīng)微量分光光度計定量，所得OD260/OD280值在1.8～2.0之間，表明純度較好，無蛋白質(zhì)和DNA污染，實驗提取的RNA的純度可用來合成cDNA。

（二）cDNA擴增

產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品在約1400bp處有一條清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1）

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

M是marker，指標(biāo)記，1-4指樣品

（三）菌液PCR鑒定

按陽性克隆的篩選與鑒定方法進(jìn)行菌液PCR鑒定，用組織分布的引物做菌液PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。從圖2可見，2、3、5、6、7、8號這7個樣品在250bp左右處有清晰條帶。即2、3、5、6、7、8號有陽性克隆。

圖2 菌液PCR電泳圖

M是marker，指標(biāo)記，1-8指樣品

（四）豬IRF6的組織分布

采用RT-PCR的方法以β-action 基因為內(nèi)參在豬的17種組織中研究了IRF6基因在豬不同組織中的表達(dá)規(guī)律，擴增片段用瓊脂糖電泳檢測（如圖3）。發(fā)現(xiàn)IRF6基因在胸腺組織中有較高水平的表達(dá)，在心、脾、肺、皮膚、脂肪、淋巴、頜下淋巴、子宮、睪丸組織中表達(dá)量相對較少，在肝、腎、空腸、十二指腸、回腸、腦、肌肉組織中不表達(dá)。

圖3組織分布電泳圖

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.空腸；7.十二指腸；8.回腸；9.腦；10.肌肉；

11.皮膚；12.脂肪；13.胸腺；14.淋巴；15.頜下淋巴；16.子宮；17.睪丸

二、討論IRF6的病理學(xué)意義

基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的Van der Woude綜合征（VWS）或相關(guān)的翼狀胬肉綜合征（PPS）。Van der Woude綜合征包括唇腭裂特征和牙齒異常和唇瘺。此外，在IRF6常見等位基因也已通過全基因組關(guān)聯(lián)研究和許多候選基因的研究與唇腭裂的非綜合征性有關(guān)。這些疾病是由IRF6基因突變引起的一些表型的異質(zhì)性是由于不同類型的IRF6基因突變。在綜合征表型變異的一個解釋是基于對二聚化的突變體蛋白的結(jié)構(gòu)差異的影響。VWS出現(xiàn)突變，導(dǎo)致單倍劑量不足而PPS的突變可能是顯性負(fù)。在VWS和PPS的突變譜最近已總結(jié)。IRF6已被證明在角質(zhì)形成細(xì)胞的發(fā)育中起著重要的作用。IRF6的功能是與結(jié)締組織的形成有關(guān)，例如口感。

三、IRF6基因在各組織中表達(dá)的結(jié)果及意義

試驗采用RT-PCR的方法研究了IRF6基因在豬不同組織中的表達(dá)規(guī)律。在試驗中，IRF6基因在檢測的17種組織中分布具有很大的差異性，實驗結(jié)果表明IRF6基因在在胸腺組織中有較高水平的表達(dá)，在心、脾、肺、皮膚、脂肪、淋巴、頜下淋巴、子宮、睪丸組織中表達(dá)量相對較少，在肝、腎、空腸、十二指腸、回腸、腦、肌肉組織中不表達(dá)。分析試驗結(jié)果可知，IRF6基因在胸腺組織中表達(dá)突出，胸腺為機體的重要淋巴器官，對免疫、分泌胸腺激素及激素類物質(zhì)有很大的影響，在脾、淋巴、皮膚等組織中均有表達(dá)，而淋巴組織構(gòu)成動物體抵抗病原菌入侵的第二道防線，脾構(gòu)成第三道防線，這表明IRF6基因有較大可能在豬的免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用。另外，該基因在子宮和睪丸中都有一定的表達(dá)，這預(yù)示著IRF6基因的表達(dá)在性腺中無性別差異； 肺是動物的呼吸器官，肝是動物的最大消化腺，并且IRF6基因在豬的肺和肝中都有一定量的表達(dá)，這表明IRF6基因有可能在豬的呼吸運動和消化作用的細(xì)胞性活動中起著一定的抑制作用； 而在空腸、十二指腸、回腸中不表達(dá)，表明IRF6基因?qū)ωi消化系統(tǒng)的功能可能并不產(chǎn)生影響。

綜上實驗結(jié)果采用RT-PCR的方法對IRF6進(jìn)行了基因克隆，并且以β-action基因為內(nèi)參，在豬的17種組織中研究了IRF6基因在豬不同組織中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步分析其生物學(xué)功能及其在各組織中的抑制作用奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步分析IRF6基因的功能提供了理論依據(jù)。