王春暉，賀嬌嬌，王思涵，郭小凱，趙明璨，劉暢

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

靜電紡絲纖維支架在軟骨組織重建中的設(shè)計(jì)應(yīng)用

王春暉，賀嬌嬌，王思涵，郭小凱，趙明璨，劉暢

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

軟骨損傷是臨床常見(jiàn)疾病之一。軟骨是一種無(wú)神經(jīng)和血管營(yíng)養(yǎng)的組織，其自身修復(fù)能力很差。組織工程學(xué)為解決這一難題提供了新方法。組織工程學(xué)主要由支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子三要素構(gòu)成。而其中支架材料是近年來(lái)組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)。靜電紡絲技術(shù)更是由于其能形成多孔隙的納米纖維支架而備受青睞。本文具體介紹靜電紡絲技術(shù)在軟骨組織工程學(xué)中的設(shè)計(jì)應(yīng)用。

組織工程；支架材料；靜電紡絲；軟骨

軟骨是一種無(wú)神經(jīng)和血管營(yíng)養(yǎng)的組織，細(xì)胞只占組織體積的5%，自身修復(fù)能力很差[1]。外傷或疾病會(huì)引起關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)性退化，最終侵及健康軟骨，導(dǎo)致疼痛和功能障礙。目前采取外科手術(shù)手段修復(fù)軟骨損傷已在臨床上廣泛應(yīng)用，但其長(zhǎng)遠(yuǎn)效果并不理想[2]。主要問(wèn)題表現(xiàn)為生物化學(xué)和生物力學(xué)性能不佳、功能受限以及免疫反應(yīng)等。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為組織缺損的修復(fù)提供了一種新辦法。組織工程學(xué)是一門(mén)新興的交叉學(xué)科，運(yùn)用生物學(xué)和工程學(xué)的原理制造生物替代品來(lái)重建、保持或者提升生物功能。生物支架是組織工程三大要素之一，它可以為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的載體。理想的組織工程支架材料應(yīng)該：容易獲取、易于加工成型；對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或低毒；對(duì)細(xì)胞粘附性好；無(wú)免疫原性或低免疫原性。

軟骨組織中90%以上成分為胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)中含有大量直徑幾十到幾百納米的纖維。這些納米纖維樣的結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了網(wǎng)狀支撐結(jié)構(gòu)。因此，納米纖維支架更貼近軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的一些特征，適用于軟骨組織工程修復(fù)[3]。

近年來(lái)涌現(xiàn)出多種制備納米纖維的方法如相分離法、自組裝法、拉伸法、模板合成法等[4]。但若綜合考慮工藝可控性、設(shè)備復(fù)雜性、成本、產(chǎn)率、適紡范圍以及纖維尺度等方面的要求，這些方法仍具有一定的局限性。然而，靜電紡絲技術(shù)是一種能夠直接、連續(xù)制備納米纖維的方法。其制備的納米纖維直徑分布一般在幾納米至幾微米之間甚至更小，比表面積更大，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞之間交流和有效地細(xì)胞應(yīng)答[5]。其制備工藝也相對(duì)簡(jiǎn)單。如何提高靜電紡纖維的生物性能，使其能更好地促進(jìn)種子細(xì)胞向目的組織分化是目前研究熱點(diǎn)。本文主要從材料選擇、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及表面形貌改建三方面做簡(jiǎn)要介紹。

1 材料選擇

靜電紡絲原料范圍極廣，主要為天然高分子和合成高分子。合成高分子聚合物易于合成和修飾，但其親水性能差并缺少細(xì)胞表面識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞親和性不足。天然高分子雖生物相容性好但機(jī)械性能較差[6]。鑒于以上原因，將天然高分子和合成高分子共混可以綜合它們的優(yōu)勢(shì)、彌補(bǔ)各自的不足。將膠原與聚己內(nèi)酯(PCL)共混靜電紡絲，與PCL靜電紡纖維相比，機(jī)械性能有損失，但延展性有所提高[7]。體內(nèi)試驗(yàn)中，共紡支架也可起到良好的支持作用。He等[8]將骨髓干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞以3：1的比例接種于明膠/PCL (50：50)共紡纖維上構(gòu)建體外三明治模型，再植入裸鼠皮下培養(yǎng)12周后可獲得軟骨樣組織。

無(wú)機(jī)物和有機(jī)物也可進(jìn)行共紡。生物醫(yī)藥方面最常用的是鹽/聚合物復(fù)合納米纖維。加入鹽溶液可以改變纖維直徑，也會(huì)改變纖維的理化性能，例如彈性模量、親水性能等。殼聚糖(CHT)生物相容性良好，但機(jī)械性能較差。Sambudi等[9]在CHT/聚乙烯醇溶液中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈣(CaCO3)(1～5 wt%)制備靜電紡納米纖維。結(jié)果表明，隨碳酸鈣質(zhì)量的增加，纖維的直徑由(71.5±23.4)nm增加到(140.7±15.1)nm。而彈性測(cè)試4 wt%CaCO3組彈性模量最大[(912.5±60.6)MPa]，與不加CaCO3組[(15.7±3)MPa]相比提高了60倍。聚碳酸亞丙酯是以二氧化碳和環(huán)氧丙烷為原料合成的一種可完全降解的環(huán)保型塑料，但其疏水且生物相容性不佳。將磷酸四鈣與聚碳酸亞丙酯溶于二氯甲烷中制備復(fù)合纖維，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證復(fù)合支架親水性有所改善，并且能支持兔骨髓干細(xì)胞增殖分化[10]。

但由于組織再生速率與材料降解速率有差異，天然聚合物與人工合成高分子材料的比例也是一個(gè)需要考慮的問(wèn)題。Neves等[11]將不同比例的CHT與PCL混合電紡支架進(jìn)行比較。分為CHT/PCL100：0、75：25、50：50組，接種牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21 d，盡管機(jī)械性能上50：50組最佳，但75：25組新生軟骨組織最多。Zheng等[12]通過(guò)對(duì)比不同比例的GT/PCL(70：30、50：50、30：70)發(fā)現(xiàn)，過(guò)高的PCL會(huì)阻礙軟骨再生?？梢?jiàn)，共混紡纖維的組成、比例都對(duì)組織的新生有影響。

共混靜電紡絲可以改善纖維的多種理化性能，但由于靜電紡絲過(guò)程影響參數(shù)較多，造成種種改變的原因還不是很清楚。并且復(fù)合纖維中各組分的分布隨機(jī)，要想提高纖維功能性應(yīng)用，必須要對(duì)纖維進(jìn)行調(diào)控。這些都是有待解決的問(wèn)題。

2 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

纖維結(jié)構(gòu)可以決定纖維性能。通過(guò)簡(jiǎn)單靜電紡設(shè)備獲得的纖維集合體是由排列無(wú)序的纖維堆積而成的。通過(guò)改良收集裝置、添加輔助電極等方法可在一定區(qū)域內(nèi)獲得定向排列的纖維。采用旋轉(zhuǎn)式收集裝置是制備有序纖維最為常見(jiàn)的一種方法，其原理是利用旋轉(zhuǎn)物體對(duì)射流的物理牽引作用以達(dá)到控制纖維排列方向的目的。取向排列纖維在耐摩擦抗磨耗上優(yōu)于無(wú)規(guī)則取向纖維，適合軟骨組織工程[13]，并且在纖維排列規(guī)則的紡絲材料上，細(xì)胞會(huì)按照纖維排列方向生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞外基質(zhì)的分泌也相對(duì)無(wú)規(guī)則取向排列纖維有所提高。Schneider等[14]將軟骨細(xì)胞分別接種于無(wú)序納米纖維膜和有序納米纖維膜上，掃描電鏡觀察顯示，細(xì)胞在無(wú)規(guī)則納米纖維膜上形態(tài)較為平展，而在有序納米纖維膜上呈現(xiàn)典型紡錘狀，并且觀察到細(xì)胞有深入到深層纖維中的跡象。Fisher等[15]為模擬半月板環(huán)形結(jié)構(gòu)，利用旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)收集器制備環(huán)狀排列納米纖維。免疫熒光染色顯示細(xì)胞可按纖維走向排列，表現(xiàn)環(huán)狀走形，與半月板解剖結(jié)構(gòu)相似。

纖維集合體的形態(tài)各異，而組成纖維集合體的單根纖維的結(jié)構(gòu)亦是種類繁多。通過(guò)靜電紡絲不僅可以制備常見(jiàn)的圓形實(shí)心纖維，還可以制備出具有特殊結(jié)構(gòu)的纖維。利用同軸電紡的方法，制備具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米纖維，內(nèi)芯嵌入生長(zhǎng)因子(TGF-β1)，外殼使用PCL對(duì)內(nèi)層蛋白形成包裹并支持細(xì)胞生長(zhǎng)，該納米纖維可促進(jìn)細(xì)胞粘附并可促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨[16]。

綜上，纖維的排列結(jié)構(gòu)與纖維的理化性能對(duì)成軟骨分化及軟骨樣組織的形成都有很大影響。這就需要我們掌握目標(biāo)組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、物理性能等，才能制備出結(jié)構(gòu)上更相似、性能上更接近的生物支架。

3 表面修飾技術(shù)

研究發(fā)現(xiàn)大部分力學(xué)性能良好的聚合物，其表面通常表現(xiàn)出生物惰性；而一些具備活潑表面性質(zhì)的聚合物，卻不具備良好的力學(xué)性能。表面修飾可以通過(guò)一些理化方法對(duì)材料表面進(jìn)行處理，使其在保持原有性能的前提下，賦予纖維新的表面性能。等離子修飾技術(shù)和表面接枝修飾技術(shù)是近年來(lái)在生物材料表面修飾中最常用的兩種技術(shù)。等離子體是部分離子化的氣體。經(jīng)等離子體處理的靜電紡纖維表面形成碳自由基，使得纖維膜的親水性大大改善，并且有利于細(xì)胞最初的粘附。經(jīng)等離子修飾后，具有碳自由基的靜電紡纖維當(dāng)其暴露在具有不飽和鍵的聚合物單體環(huán)境中時(shí)，將會(huì)引發(fā)接枝聚合反應(yīng)。靜電紡左旋聚乳酸(PLLA)經(jīng)氧氣等離子體修飾后，浸于陽(yáng)離子凝膠中，獲得修飾后的靜電紡纖維。與對(duì)照組(未經(jīng)處理PLLA靜電紡纖維)相比實(shí)驗(yàn)組納米纖維更利于細(xì)胞的粘附遷移與增殖，且能促進(jìn)細(xì)胞分化[17]。運(yùn)用表面活性處理劑也可以達(dá)到激發(fā)表面活性的目的。聚氨酯經(jīng)二羥基烷處理后產(chǎn)生自由基，浸泡于纖維蛋白結(jié)合溶液中發(fā)生接枝反應(yīng)。經(jīng)處理后的纖維膜接種細(xì)胞后，細(xì)胞分泌膠原增多，且細(xì)胞排列也較為規(guī)則[18]。

近年來(lái)脫細(xì)胞基質(zhì)由于其獨(dú)特的生物特性在組織工程領(lǐng)域也有廣闊應(yīng)用。也可以利用脫細(xì)胞基質(zhì)對(duì)靜電紡纖維膜進(jìn)行表面修飾。Liao等[19]先將軟骨細(xì)胞接種于聚己內(nèi)酯纖維上，培養(yǎng)9 d后進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得脫細(xì)胞基質(zhì)包被的纖維支架，該支架可有效誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化，效果與生長(zhǎng)因子(TGF-β3)相似。也有學(xué)者選擇共培養(yǎng)細(xì)胞制備脫細(xì)胞基質(zhì)，也可達(dá)到誘導(dǎo)目的[20]。

4 總 結(jié)

總的來(lái)說(shuō)，靜電紡絲以其制造裝置簡(jiǎn)單、紡絲成本低廉、可紡物質(zhì)種類繁多、工藝可控等優(yōu)點(diǎn)，已成為有效制備納米纖維材料的主要途徑之一。在軟骨組織工程中仍有廣闊的前景。但其面臨一些有待解決的問(wèn)題。首先，用于靜電紡絲的天然高分子品種有限，對(duì)所得產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和性能研究還不夠完善，目前都處于實(shí)驗(yàn)室階段，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還存在較大問(wèn)題。其次，在纖維結(jié)構(gòu)調(diào)控方面還面臨一些挑戰(zhàn)。從實(shí)驗(yàn)研究到全面介入臨床、服務(wù)患者，靜電紡絲纖維作為生物支架還有很長(zhǎng)的路要走。這都需要研究者繼續(xù)開(kāi)展深入的研究工作。

[1]Feng G,Wan Y,Bal ian G,et al.Adenovirus-mediated expression of growth and differentiation factor-5 promotes chondrogenesis of adipose stem cells[J].Growth Factors,2008,26(3):132-142.

[2]Johnstone B,Alini M,Cucchiarini M,et al.Tissue engineering for articular cartilage repair—the state of the art[J].Eur Cell Mater,2013, 25(248):248-263.

[3]Ghasemi-Mobarakeh L,Prabhakaran M P,Balasubramanian P,et al. Advances in electrospun nanofibers for bone and cartilage regeneration[J].Journal of Nanoscience and Nanotechnology,2013,13(7): 4656-4671.

[4]Braghirolli DI,Steffens D,Pranke P.Electrospinning for regenerative medicine:a review of the main topics[J].Drug Discovery Today, 2014,19(6):743-753.

[5]Liu W,Thomopoulos S,Xia Y.Electrospun nanofibers for regenerative medicine[J].Advanced Healthcare Materials,2012,1(1):10-25.

[6]Holmes B,Castro NJ,Zhang LG,et al.Electrospun fibrous scaffolds for bone and cartilage tissue generation:recent progress and future developments[J].Tissue Engineering Part B:Reviews,2012,18(6): 478-486.

[7]Chen ZCC,Ekaputra AK,Gauthaman K,et al.In vitro and in vivo analysis of co-electrospun scaffolds made of medical grade poly (ε-caprolactone)and porcine collagen[J].Journal of Biomaterials Science,Polymer Edition,2008,19(5):693-707.

[8]He X,Feng B,Huang C,et al.Electrospun gelatin/poly-caprolactone nanofibrous membranes combined with a co-culture of bone marrow stromal cells and chondrocytes for cartilage engineering[J].International Journal of Nanomedicine,2015,10(1):2089-2099.

[9]Sambudi NS,Sathyamurthy M,Lee GM,et al.Electrospun chitosan/ poly(vinyl alcohol)reinforced with CaCO3nanoparticles with enhanced mechanical properties and biocompatibility for cartilage tissue engineering[J].Composites Science and Technology,2015,106 (7):76-84.

[10]Deng JJ,Wang YL,Zhou LX,et al.Fabrication and in vivo chondrification of a poly(propylene carbonate)/l-lactide-grafted tetracalcium phosphate electrospun scaffold for cartilage tissue engineering[J]. RSCAdvances,2015,5(53):42943-42954.

[11]Neves SC,Moreira Teixeira LS,Moroni L,et al.Chitosan/Poly (ε-caprolactone)blend scaffolds for cartilage repair[J].Biomaterials, 2011,32(4):1068-1079.

[12]Zheng R,Duan H,Xue J,et al.The influence of gelatin/PCL ratio and 3-D construct shape of electrospun membranes on cartilage regeneration[J].Biomaterials,2014,35(1):152-164.

[13]Accardi MA,McCullen SD,Callanan A,et al.Effects of fiber orientation on the frictional properties and damage of regenerative articular cartilage surfaces[J].Tissue Engineering Part A,2013,19(19-20): 2300-2310.

[14]Schneider T,Kohl B,Sauter T,et al.Influence of fiber orientation in electrospun polymer scaffolds on viability,adhesion and differentiation of articular chondrocytes[J].Clinical Hemorheology and Microcirculation,2012,52(2):325-336.

[15]Fisher MB,Henning EA,S?egaard N,et al.Organized nanofibrous scaffolds that mimic the macroscopic and microscopic architecture of the knee meniscus[J].Acta biomaterialia,2013,9(1):4496-4504.

[16]Man Z,Yin L,Shao Z,et al.The effects of co-delivery of BMSC-affinity peptide and rhTGF-β1from coaxial electrospun scaffolds on chondrogenic differentiation [J].Biomaterials,2014,35(19): 5250-5260.

[17]Chen JP,Su CH.Surface modification of electrospun PLLA nanofibers by plasma treatment and cationized gelatin immobilization for cartilage tissue engineering[J].Acta Biomaterialia,2011,7(1): 234-243.

[18]Attia M,Santerre JP,Kandel RA.The response of annulus fibrosus cell to fibronectin-coated nanofibrous polyurethane-anionic dihydroxyoligomer scaffolds[J].Biomaterials,2011,32(2):450-460.

[19]Liao J,Guo X,Grande-Allen KJ,et al.Bioactive polymer/extracellular matrix scaffolds fabricated with a flow perfusion bioreactor for cartilage tissue engineering [J].Biomaterials,2010,31(34): 8911-8920.

[20]Levorson EJ,Hu O,Mountziaris PM,et al.Cell-derived polymer/extracellular matrix composite scaffolds for cartilage regeneration,Part 2:construct devitalization and determination of chondroinductive capacity[J].Tissue Engineering Part C:Methods,2013,20(4):358-372.

Application of electrospinning technology in the cartilage tissue engineering.

WANG Chun-hui,HE Jiao-jiao,WANG Si-han,GUO Xiao-kai,ZHAO Ming-can,LIU Chang.School of Stomatology,Jilin University,Changchun 130021,Jilin, CHINA

Cartilage injury is one of clinical common diseases.Since cartilage is a kind of tissue without nerves and blood vessels,its self-repair ability is limited.Tissue engineering provides an approach to solve this problem.Tissue engineering is mainly composed of scaffolds,seeding cells and growth factors.And the scaffold material is a hot spot in the research of tissue engineering in recent years.Electrospinning can produce polymer fibers with diameters down to nanoscale dimensions and form high porosity non-woven mat.This paper introduces the application of electrospinning technology in the cartilage tissue engineering.

Tissue engineering;Scaffolds;Electrospinning;Cartilage

R329.3

A

1003—6350（2016）19—3197—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.19.034

2015-12-21)

劉暢。E-mail：lcwztt@gmail.com