索冬衛(wèi)，陳炅，孫秋虹，張玉華（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南鄭州450052）

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消退素D1對(duì)百草枯致急性肺損傷大鼠肺泡表面活性物質(zhì)與巨噬細(xì)胞的影響

索冬衛(wèi)，陳炅，孫秋虹，張玉華
（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南鄭州450052）

摘要：目的探討消退素D1對(duì)于百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠體內(nèi)肺泡表面活性物質(zhì)水平和肺泡巨噬細(xì)胞功能的影響。方法將90只健康雄性SD大鼠完全隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（C組：生理鹽水2.5 ml/kg、生理鹽水2.5 ml/kg）、百草枯組（P組：百草枯60 mg/kg、生理鹽水2.5 ml/kg）、消退素D1組（Rv組：百草枯60 mg/kg、消退素5μg/kg）。按照分組情況，每組分別給予規(guī)定量的生理鹽水或百草枯灌胃造模，3 h后再給予規(guī)定量的生理鹽水或消退素D1尾靜脈注射。百草枯給藥24 h后取大鼠肺臟組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)其中肺泡表面活性蛋白A、B及C-mRNA的表達(dá)水平，采用BCA法測(cè)定肺泡灌洗液中總蛋白含量。采用體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞研究消退素D1對(duì)其功能的影響。結(jié)果3組大鼠肺泡表面3種活性蛋白mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中對(duì)照組大鼠肺泡表面活性蛋白的表達(dá)量最高，消退素D1組其次，百草枯組最低（P＜0.05）。3組大鼠肺泡灌洗液中總蛋白含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中消退素D1組大鼠灌洗液中總蛋白的含量最高，百草枯組其次，對(duì)照組最低（P＜0.05）。加入百草枯的體外培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素-6 （IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和乳酸脫氫酶（LDH）含量增加（P＜0.05），同時(shí)，消退素D1可以降低由于百草枯導(dǎo)致的IL-6、TNF-α和LDH含量的增加（P＜0.05）。結(jié)論消退素D1可通過(guò)促進(jìn)肺泡表面活性蛋白表達(dá)、抑制巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α和LDH等炎癥因子來(lái)達(dá)到治療由百草枯導(dǎo)致的急性肺損傷的目的。

關(guān)鍵詞：消退素D1；百草枯；急性肺損傷；巨噬細(xì)胞

百草枯，即1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，具有觸殺作用和內(nèi)吸入作用[1]。能迅速被植物綠色組織吸收，使其枯死，但對(duì)植物根部及多年生地下莖無(wú)效。百草枯對(duì)人畜具有很大的毒性作用，且尚無(wú)特效解毒藥，有數(shù)據(jù)顯示[2]，口服百草枯的死亡率高達(dá)90%。肺部是百草枯主要的靶器官，它造成的急性肺損傷（acute pulmonary injury，ALI）是致死的主要原因[3]。ALI是指由于各種原因造成的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肺泡及肺間質(zhì)水腫[4]。ALI的臨床病死率很高，患者即使度過(guò)急性期，也有可能由于后續(xù)的肺纖維化導(dǎo)致死亡[5]。因此對(duì)與由百草枯造成的ALI的治療方法還有待進(jìn)一步探究。消退素D1（resolving D1，RvD1）是一種不飽和脂肪酸的衍生物，不僅可以抗炎，還具有促進(jìn)炎癥消退的作用。已有不少研究表明[6]，RvD1對(duì)由脂多糖引發(fā)的肺水腫具有一定的治療作用，可降低其致死率。本研究旨在探討消退素D1對(duì)百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠體內(nèi)肺泡表面活性物質(zhì)水平和肺泡巨噬細(xì)胞功能的影響。以期為將來(lái)百草枯中毒的治療提供一定的研究參考。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇一級(jí)雄性SD大鼠95只。月齡2.5～4.0個(gè)月，平均（3.1±0.6）個(gè)月；體重（200±20）g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。所有大鼠在研究期間均飼養(yǎng)與20～25℃條件下，給予普通顆粒飼料和自來(lái)水。所有大鼠月齡、體重等基本資料上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將其中90只大鼠完全隨機(jī)分為3組，每組30只：對(duì)照組：灌胃2.5 ml/kg生理鹽水、3 h后再尾靜脈注射2.5 ml/kg生理鹽水；百草枯組：灌胃60 mg/kg百草枯、3 h后再尾靜脈注射2.5 ml/kg生理鹽水；消退素D1組：灌胃百草枯60 mg/kg、3 h后再尾靜脈注射5μg/kg消退素D1溶液。所有大鼠均于灌胃給藥后24 h處死，收集大鼠右肺組織，保存于-70℃環(huán)境下，用于檢測(cè)其中肺泡表面活性蛋白（surfactant protein，SP）A、B及C-mRNA的表達(dá)水平；同時(shí)收集左肺肺泡灌洗液，離心過(guò)濾后取上清液，保存于-70℃環(huán)境下，用于測(cè)定肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中總蛋白（total protein，TP）含量。

另取5只大鼠，行肺泡巨噬細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。具體操作步驟為：收集健康大鼠的肺泡灌洗液，離心后收集細(xì)胞團(tuán)，先將細(xì)胞團(tuán)接種于含有血清的培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后再將其接種于不含血清的培養(yǎng)基中。此時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：對(duì)照組：不添加任何藥物；百草枯組：培養(yǎng)基中加入最終濃度為8 mg/L的百草枯溶液；消退素D1組：培養(yǎng)基中加入最終濃度為8 mg/L的百草枯溶液和4 mmol/L的消退素D1。無(wú)血清培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)4 h后，收集其上清液用以測(cè)定其中白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量。

1.2研究方法

1.2.1材料與試劑熒光定量PCR儀器（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，BTK-6系列），RNA提取試劑盒，RP5101（北京百泰克生物生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit，AORT-0020（廣州錦生物技術(shù)有限公司），熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒Fast Fire qPCR Pre Mix（SYBR Green），F(xiàn)P207[天根生化科技（北京）有限公司]，BCA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司），大鼠IL-6、TNF-α和LDH ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2.2SP-A、SP-B及SP-C mRNA表達(dá)水平檢測(cè)首先，提取目標(biāo)RNA。采用RNA提取試劑盒在嚴(yán)格的無(wú)RNA酶和無(wú)菌條件下按照試劑盒操作步驟提取RNA。注意提取過(guò)程保持低溫，防止RNA降解。采用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的完整性。而后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下按照試劑盒標(biāo)示劑量加入所有試劑。隨后在40℃條件下孵育45 min，緊接著用90℃高溫失活逆轉(zhuǎn)錄酶。最后，采用Quant Studio3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（賽默飛世爾科技公司）擴(kuò)增和定量檢測(cè)標(biāo)本中SP-A、SP-B和SP-C mRNA的表達(dá)量。

1.2.3BALF中TP檢測(cè)使用4℃的生理鹽水經(jīng)導(dǎo)管注入大鼠左肺，用量為10 ml/kg，按摩左肺5 min左右，抽出其中的生理鹽水并收集，重復(fù)該過(guò)程5次，得到BALF，采用BCA試劑盒檢測(cè)其中TP含量，按照BCA試劑盒步驟嚴(yán)格操作。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和LDH含量檢測(cè)無(wú)血清培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)4 h后，收集其上清液，使用大鼠IL-6、TNF-α和LDH ELISA試劑盒測(cè)定其含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究各組各項(xiàng)指標(biāo)間的差異進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。對(duì)3組大鼠的所有生理指標(biāo)用方差進(jìn)行分析處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SP-A、SP-B及SP-C mRNA表達(dá)水平

3組大鼠3種肺泡表面活性蛋白的mRNA表達(dá)水平對(duì)比見(jiàn)表1。通過(guò)比較，3組大鼠的肺泡表面活性蛋白mRNA表達(dá)量間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，對(duì)照組大鼠的肺泡表面活性蛋白mRNA表達(dá)量最高，消退素D1組大鼠次之，百草枯組大鼠最低。

2.2BALF中總蛋白含量

3組大鼠肺泡灌洗液中總蛋白含量對(duì)比見(jiàn)表2。通過(guò)比較，3組大鼠BALF中TP含量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，對(duì)照組大鼠的TP含量最低，消退素D1組大鼠次之，百草枯組大鼠最高。

2.3IL-6、TNF-α和LDH含量

3組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α和LDH含量對(duì)比見(jiàn)表3，3組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α和LDH含量之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，對(duì)照組大鼠的三者含量最低，消退素D1組大鼠次之，百草枯組大鼠最高。

3　討論

本研究對(duì)大鼠急性肺損傷造模時(shí)，并沒(méi)有選用現(xiàn)在大量肺損傷研究造模時(shí)用到的脂多糖，而選用的是百草枯。這主要是由于百草枯在造成人畜中毒時(shí)，主要的損傷部位就是肺臟，同時(shí)現(xiàn)在臨床上對(duì)百草枯中毒的解救還沒(méi)有找到特效藥，百草枯造成肺損傷的機(jī)制也尚不清楚。因此，本研究使用百草枯造模后再用消退素D1解救，以期可以發(fā)現(xiàn)解救百草枯造成的急性肺損傷的更加有效的方法。

表1　SP-A、SP-B及SP-C mRNA表達(dá)水平（n=30±s）

表1　SP-A、SP-B及SP-C mRNA表達(dá)水平（n=30±s）

組別　SP-A mRNA　SP-B mRNA　SP-C mRNA對(duì)照組　1.34±0.11　1.21±0.08　0.93±0.03百草枯組　0.53±0.14　0.67±0.06　0.47±0.02消退素D1組　0.89±0.09　1.01±0.05　0.74±0.03 F值　6.324　5.426　4.377 P值　0.003　0.007　0.015

表2　BALF中總蛋白含量（±s）

表2　BALF中總蛋白含量（±s）

組別　例數(shù)　TP/（g/L）對(duì)照組　30　0.31±0.04百草枯組　30　0.84±0.10消退素D1組　30　0.51±0.06 F值　5.013 P值　0.008

表3　IL-6、TNF-α和LDH含量（n=30±s）

表3　IL-6、TNF-α和LDH含量（n=30±s）

組別　IL-6/（pg/L）　TNF-α/（pg/L）　LDH/（u/L）對(duì)照組　95.43±8.45　256.94±13.56　104.59±9.54百草枯組　173.09±12.43　564.85±12.74　185.07±11.27消退素D1組　120.43±9.76　298.06±10.49　134.96±9.75 F值　32.658　18.495　28.593 P值　0.000　0.000　0.000

急性肺損傷中的重要一環(huán)就是肺泡表面活性物質(zhì)的合成減少和破壞，肺泡表面活性物質(zhì)包括磷脂和蛋白，本研究主要關(guān)注3種表面活性蛋白SP-A，SP-B和SP-C。這3種蛋白中，SP-A是親水性蛋白[7]，主要功能為免疫防御，它可以與進(jìn)入肺部的微粒和微生物等結(jié)合，協(xié)助吞噬細(xì)胞完成吞噬過(guò)程，它同時(shí)還可以抑制多種炎癥因子的釋放。SP-B和SP-C是親脂性蛋白[8]，主要功能是保持肺泡表面張力，幫助維持磷脂分子在肺泡表面的正常排列，保持肺泡不坍塌。當(dāng)發(fā)生急性肺損傷時(shí)，這3種蛋白將受到不同程度的影響。從本研究中可以看出，由百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷中，這3種蛋白的mRNA表達(dá)水平都明顯降低。但同時(shí)，筆者也觀察到，在肺泡灌洗液中，總蛋白的含量在百草枯組是遠(yuǎn)高于對(duì)照組的。這是由于急性肺損傷會(huì)造成肺-血屏障被破壞，本來(lái)處于肺組織中的表面活性蛋白外溢，出現(xiàn)在血清中?，F(xiàn)在，已經(jīng)有越來(lái)越多的臨床工作者提議將血清中SP-A、SP-B和SP-C這3種蛋白在血清中的水平作為診斷肺損傷的依據(jù)之一[9]。急性肺損傷時(shí)，肺組織細(xì)胞的這些改變與炎癥因子的大量釋放和ROS的大量釋放有關(guān)。筆者從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，百草枯導(dǎo)致體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α和LDH。

如前所述，急性肺損傷時(shí)，肺組織細(xì)胞的這些改變與炎癥因子的大量釋放和ROS的大量釋放有關(guān)。消退素D1是一種不飽和脂肪酸的衍生物，有研究表明[10]，RvD1可以促進(jìn)血紅素氧合酶HO-1的生成和表達(dá)。OH-1可以通過(guò)促進(jìn)cGMP的生成激活細(xì)胞保護(hù)通路。該通路已被證實(shí)廣泛的存在于損傷細(xì)胞中[11]。從本研究中可以發(fā)現(xiàn)，給予RvD1治療的大鼠，在百草枯造成急性肺損傷以后，出現(xiàn)3種肺泡表明活性蛋白mRNA表達(dá)水平上升，肺泡灌洗液中總蛋白含量降低，同時(shí)體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子減少的現(xiàn)象。綜上所述，RvD1對(duì)于百草枯中毒后改善肺部損傷具有積極作用。

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（王榮兵編輯）

Effect of resolvin D1 on surfactant and alveolar macrophages in rats with Paraquat-induced acute pulmonary injury

Dong-wei Suo, Hao Chen, Qiu-hong Sun, Yu-hua Zhang
(The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450052, China)

Abstract:Objective To investigate the effect of resolvin D1 on pulmonary surfactant and alveolar macrophages (AM) in rats with pulmonary injury which was induced by Paraquat. Methods Ninety rats with pulmonary injury were randomly divided into 3 groups: control group (group C, normal saline, normal saline), Paraquat group (group P, Paraquat, normal saline) and resolvin D1 group (group Rv, Paraquat, resolvin D1). According to the grouping information, normal saline or Paraquat was given for modeling, and 3 hours later resolvin D1 or normal saline was given for treatment. The rat lung tissues were collected 24 hours after modeling to detect the mRNA expression levels of of surfactant proteins A, B and C using RT-PCR. The total protein in the bronchial alveolar lavage fluid (BALF) was also detected. The effect of resolvin D1 on AM was measured on isolated rat AM. Results The expression of three surfactant protein mRNAs in the three groups was different, where the expression level was the highest in the group C, the second in the group Rv, and the lowest in the group P(P＜0.05). The total protein content in BALF was also different, where it was thebook=24,ebook=30highest in the group C, the second in the group Rv, and the lowest in the group P (P＜0.05). The content of IL-6, TNF-α and LDH increased when Paraquat was added to in vitro culture medium (P＜0.05); while adding resolvin D1 reversed it (P＜0.05). Conclusions Resolvin D1 can help to treat pulmonary injury induced by Paraquat through boosting the expression of surfactant proteins and inhibiting the release of IL-6, TNF-α and LDH.

Keywords:resolvin D1; Paraquat; pulmonary injury; alveolar macrophage

收稿日期：2015-09-17

文章編號(hào)：1005-8982（2016）03-0023-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.005

中圖分類號(hào)：R563.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A