李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

·實(shí)驗(yàn)研究·

mTOR信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中激活的意義研究

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

目的探討哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中激活的意義。方法通過Hoechst33342染色流式細(xì)胞儀,利用Western blot法和熒光定量-PC R法對非側(cè)群(NSP)細(xì)胞和側(cè)群(SP)細(xì)胞中的mTOR信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中激活的意義進(jìn)行分析研究。結(jié)果光定量PCR檢測NSP和SP細(xì)胞中,mTOR基因的2-△Ct值為(0.289±0.042)和(0.623±0.021),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),Western blot檢測結(jié)果證實(shí),SP細(xì)胞的mTOR蛋白表達(dá)也明顯高于NSP細(xì)胞(P＜0.05)。結(jié)論神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中存在mTOR高表達(dá)現(xiàn)象。

mTOR信號通路；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；干細(xì)胞

惡性腫瘤是除心血管疾病以外,人類健康的第二大殺手,而神經(jīng)膠質(zhì)瘤又是惡性腫瘤中最為常見的一種類型,主要治療方式為手術(shù)治療,但患者存在一定的術(shù)后復(fù)發(fā)率,術(shù)后死亡率也相對較高。腫瘤干細(xì)胞理論研究結(jié)果提出,腫瘤內(nèi)存在的部分腫瘤起始細(xì)胞是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的主要原因,而這也為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的途徑。本次醫(yī)學(xué)研究就對mTOR信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中激活的意義進(jìn)行了研究,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及培養(yǎng) 細(xì)胞系及其培養(yǎng)方法: 用5%二氧化碳在37℃條件下進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的培養(yǎng),PRMI 1640培養(yǎng)液中含有100 IU/ml鏈霉素、100 IU/ml青霉素及10%胎牛血。

1.2試劑 本研究所用試劑包括: 美國 cell signalling 公司生產(chǎn)的mTOR、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,北京天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的Trizol、SYBR Green 熒光定量檢測 PCR 試劑盒,美國 Santa Cruz 公司生產(chǎn)的特異性mTOR 靶向 siRNA,英韋創(chuàng)津公司生產(chǎn)的Lipofectin2000、PRMI 1640 培養(yǎng)基,美國Millopore 公司生產(chǎn)的干細(xì)胞培養(yǎng)基,美國 Gibco 公司生產(chǎn)的胎牛血清,美國Sigma 公司生產(chǎn)的Hoechst33342和維拉帕米、鏈霉素、青霉素。

1.3熒光定量 PCR 檢測mTOR 基因表達(dá) 分別選擇NSP和SP細(xì)胞,PBS進(jìn)行2次洗滌,根據(jù)Trizol 說明書要求對細(xì)胞總 RNA進(jìn)行提取,反轉(zhuǎn)錄出第 1 鏈cDNA,根據(jù) SYBR Green 熒光定量 PCR 檢測試劑盒說明書要求,進(jìn)行 mTOR 基因表達(dá)量的檢測。使用2-△Ct值表示基因的表達(dá)量,Ct值表示基因擴(kuò)增達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù),△Ct值越小,則證實(shí)基因的表達(dá)就越多,相應(yīng)的2-△Ct值越小就說明該基因的表達(dá)就越少,△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.4側(cè)群(SP)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分選 按照Goodell等研究人員提出的方案,對SP細(xì)胞的流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,具體如下方法: 選擇對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞,在5 mg/L的Hoechst 33342中加入106/ml單細(xì)胞懸液,同時(shí),提前30 min選擇1 ml細(xì)胞,并加入50 mg/L維拉帕米,后加入Hoechst 33342 作為對照,選擇相應(yīng)的SP亞群,連續(xù)90 min在37℃的水浴避光染色。通過美國BD 公司生產(chǎn)的IL6 和 IL7 雙通道做門FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀,參考維拉帕米對照樣品對SP細(xì)胞群進(jìn)行選擇,并在37℃無菌條件下分選。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

熒光定量PCR檢測結(jié)果證實(shí),在NSP和SP細(xì)胞中,mTOR基因的2-△Ct值為(0.289±0.042)和(0.623±0.021),兩個(gè)檢測結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。Western blot檢測結(jié)果證實(shí),SP細(xì)胞的mTOR蛋白表達(dá)也明顯高于NSP細(xì)胞。見圖2。

圖1 熒光定量PCR檢測,NSP和SP細(xì)胞的mTOR表達(dá)

圖2 Western blot檢測,NSP和SP細(xì)胞的mTOR表達(dá)

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是一種具有自我更新潛能和高增生潛能的一小群腫瘤起始細(xì)胞,現(xiàn)階段臨床常用的腫瘤干細(xì)胞分選方法包括Hoechst 33342 染色流式細(xì)胞儀SP 細(xì)胞分選、無血清球囊懸浮培養(yǎng)富集、免疫標(biāo)記分選幾種［1］,其主要原因是特異性標(biāo)記的腫瘤干細(xì)胞蛋白在特定的腫瘤中并不顯著,血清懸浮培養(yǎng)條件較為嚴(yán)苛,但耗時(shí)相對較少［2］,因此,SP細(xì)胞分選也是腫瘤干細(xì)胞的常見分選方法,已有的醫(yī)學(xué)研究結(jié)果證實(shí),SP細(xì)胞分選是一種最為簡便且有效的富集神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞分選技術(shù)［3］。

mTOR信號通路對于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增值和生長具有十分重要的作用,其存在于腫瘤及其基因的發(fā)生和發(fā)展的全過程之中,且這一過程中mTOR 通路的激活起到了明顯的促進(jìn)作用［4,5］。mTOR屬于核心絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶的一種,能夠使其底物 pS6K和 4E-BPl磷酸化,產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng),進(jìn)而加速蛋白質(zhì)的翻譯,其中包括一些促生長、細(xì)胞周期調(diào)控、抗凋亡等蛋白的表達(dá)。

［1］張宇,傘永志,朱玉蘭.mTOR信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制研究進(jìn)展.卒中與神經(jīng)疾病,2013,20(6):381-382.

［2］王通,劉玉光,張良文,等.阻斷EGFR和mTOR信號通路對C6膠質(zhì)瘤及其干細(xì)胞的影響.山東大學(xué)學(xué)報(bào),2013,7(5):37-38.

［3］周福安,古麗娜爾·阿布拉江,張志明,等.PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2012,25(4):278-279.

［4］李雪源,賈愛華,任玉波,等.mTOR 信號通路蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義.中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(1):75-76.

［5］李進(jìn)軍,劉顯志,王雪峰,等.mTOR /eIF4E信號通路在不同級別人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(23):2549-2550.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.08.224

2016-12-29］

450000 河南省鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)外科