張煥，苑韜，時(shí)艷杰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

丙泊酚對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能及海馬區(qū)nNOS、血清β-淀粉樣蛋白的影響

張煥，苑韜，時(shí)艷杰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

目的 探討丙泊酚對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力的影響及其可能的機(jī)制。方法選擇30只12個(gè)月齡SD大鼠，按分層隨機(jī)區(qū)組法隨機(jī)分為三組，每組10只，即訓(xùn)練組、丙泊酚低劑量組和高劑量組。麻醉結(jié)束后24 h，采用不固定訓(xùn)練次數(shù)隨機(jī)法連續(xù)5 d進(jìn)行水迷宮的行為學(xué)測(cè)試：記錄各組的逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)。測(cè)試結(jié)束抽取大鼠血后立即斷頭取腦，采用免疫組化染色法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)腦組織nNOS的表達(dá)情況及大鼠血清中β-淀粉樣蛋白含量。結(jié)果12個(gè)月齡SD大鼠丙泊酚麻醉后各組同時(shí)段水迷宮行為學(xué)測(cè)試的結(jié)果顯示：高劑量組與訓(xùn)練組比較，逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，t=12.142、5.63)；低劑量組與訓(xùn)練組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，t=0.386、0.773)。免疫組化染色的結(jié)果顯示：高劑量組海馬區(qū)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和積分光密度值(IOD)明顯低于低劑量組和訓(xùn)練組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，t=12.072、11.646)；低劑量組與訓(xùn)練組比較，兩項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，t=0.642)。高劑量組與低劑量組、訓(xùn)練組比較，血清β-淀粉樣蛋白含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，t=11.692、10.354)；低劑量組與訓(xùn)練組比較，兩組血清β-淀粉樣蛋白含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，t=0.082)。結(jié)論多次高劑量丙泊酚注射麻醉誘導(dǎo)及維持對(duì)老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知功能損害與海馬區(qū)nNOS表達(dá)的抑制程度和血清β-淀粉樣蛋白含量有關(guān)。

丙泊酚；老年大鼠；認(rèn)知功能；一氧化氮合酶；β-淀粉樣酶

近年來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，持續(xù)應(yīng)用某些全身靜脈麻醉藥物能夠?qū)?dòng)物的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能產(chǎn)生不良影響，發(fā)生術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)。通過(guò)臨床觀察和循證醫(yī)學(xué)調(diào)查，老年患者全身麻醉后發(fā)生POCD的比例相對(duì)較高[1]，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為大腦海馬區(qū)中的神經(jīng)元型一氧化氮合酶(Neuron nitric oxide synthetase，nNOS)可能參與了學(xué)習(xí)記憶的重要環(huán)節(jié)和過(guò)程，同時(shí)nNOS又是合成神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮(Nitric oxide，NO)的關(guān)鍵酶[2]。由于淀粉樣蛋白(Aβ)是神經(jīng)系統(tǒng)損傷和持續(xù)性炎癥反應(yīng)的潛在標(biāo)志物之一，因此還有學(xué)者認(rèn)為POCD與麻醉藥物的使用和其引起β-淀粉樣蛋白的表達(dá)有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)在建立丙泊酚麻醉動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)Morris水迷宮進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試，觀察丙泊酚對(duì)老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能的影響，同時(shí)采用免疫組化方法及測(cè)定大鼠血清中β-淀粉樣蛋白含量，為探討丙泊酚麻醉后老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力變化的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及麻醉方法 正式實(shí)驗(yàn)前采用Morris水迷宮預(yù)先對(duì)所有大鼠進(jìn)行游泳試驗(yàn)，以淘汰先天運(yùn)動(dòng)功能障礙的大鼠。所有實(shí)驗(yàn)大鼠由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。選用通過(guò)測(cè)試的健康清潔級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量(291.26±9.41)g，12個(gè)月齡、雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前1 d使所有大鼠自由攝食飲水并熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。按分層隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為三組，每組10只：訓(xùn)練組、低劑量組和高劑量組。訓(xùn)練組大鼠予以腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 mL，對(duì)低劑量組實(shí)施麻醉誘導(dǎo)時(shí)給予腹腔注射1%丙泊酚(捷力康英國(guó))50 mg/kg，高劑量組大鼠實(shí)施麻醉誘導(dǎo)時(shí)給予腹腔注射1%丙泊酚(捷力康英國(guó))100 mg/kg，麻醉維持期間分別每小時(shí)追加首次劑量的半量并持續(xù)6 h。所有大鼠每次腹腔注射相應(yīng)實(shí)驗(yàn)劑量的藥物后立即放入吸氧箱內(nèi)，持續(xù)吸入純氧，流量5 L/min。翻正反射完全恢復(fù)正常后，立即從吸氧箱中取出大鼠完成動(dòng)物模型的建立。麻醉期間用脈搏血氧飽和度監(jiān)護(hù)儀的探頭貼于大鼠腹部持續(xù)監(jiān)測(cè)脈搏氧飽和度，以防麻醉過(guò)深導(dǎo)致的大鼠缺血缺氧性腦損害對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.2 動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試 連續(xù)用藥6 d后以Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試，實(shí)驗(yàn)前，將平臺(tái)置于水迷宮東北象限中央，沒(méi)于水下2 cm，水池內(nèi)加入適量墨汁，使大鼠無(wú)法識(shí)別平臺(tái)，在迷宮池壁外粘貼幾件物體作為參照物，將水溫加熱至24°C～26°C。定位航行實(shí)驗(yàn)設(shè)定為5 d，每天固定分上下午兩個(gè)時(shí)間段，每時(shí)間段分別訓(xùn)練4次。將大鼠分別從不同象限把動(dòng)物放入水中，利用秒表記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，每次間隔時(shí)間設(shè)定為1 min。第5天下午施行空間探索實(shí)驗(yàn)，移出平臺(tái)，將大鼠從西南象限放入水中，用攝像機(jī)記錄2 min內(nèi)動(dòng)物在迷宮中的游泳路徑并記錄穿越平臺(tái)位置次數(shù)作為記憶成績(jī)。

1.3 神經(jīng)型一氧化氮合酶檢測(cè) 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)束后立即抽取各組大鼠血3 mL，以3 000 r/min離心5 min，吸取血清置于-30°C待測(cè)。再以4%多聚甲醛預(yù)灌注后斷頭取腦，采用免疫組化SP法對(duì)各組大鼠海馬組織中的nNOS進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)制備石蠟切片后，脫蠟至水化，再采用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，分別依次滴加3%H2O2，山羊血清，一抗(1:500稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗，37℃孵育1h，滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片后，在數(shù)碼顯微鏡下采集照片，應(yīng)用Leica Q550CW圖象采集和分析系統(tǒng)，取每只大鼠海馬區(qū)3張切片進(jìn)行鏡下(40×10)觀察，選取每張切片5個(gè)互不重疊的視野，測(cè)定其單位面積陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的光密度值，分別采集5個(gè)視野的平均光密度值作為本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以反映nNOS陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.4 淀粉樣蛋白含量檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分別檢測(cè)各組待測(cè)大鼠血清，測(cè)定血清中的淀粉樣蛋白含量，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)比較 高劑量組與訓(xùn)練組相比，逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；低劑量組與訓(xùn)練組相比，兩項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠水迷宮結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠水迷宮結(jié)果(±s)

注：高劑量組與訓(xùn)練組比較(高劑量組與訓(xùn)練組逃避潛伏期at=12.142，高劑量組與訓(xùn)練組空間探索at=5.63)，aP＜0.01。低劑量組與訓(xùn)練組比較(低劑量組與訓(xùn)練組逃避潛伏期bt=0.386，低劑量組與訓(xùn)練組空間探索bt=0.773)，bP＞0.05。

組別 只數(shù) 逃避潛伏期(s)空間探索(穿越平臺(tái)次數(shù))訓(xùn)練組低劑量組高劑量組10 10 10 1.900 0±1.042 68a2.100 0±1.261 88b21.200 0±4.917 09a6.200 0±1.635 29a6.800 0±1.829 27b2.500 0±1.281 14a

2.2 各組海馬區(qū)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞和積分光密度值(IOD)比較 免疫組化染色的結(jié)果顯示：高劑量組海馬區(qū)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和積分光密度值(IOD)明顯低于訓(xùn)練組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而低劑量組與訓(xùn)練組比較，兩項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織中nNOS平均光密度(±s)

表2 各組大鼠海馬組織中nNOS平均光密度(±s)

注：高劑量組與訓(xùn)練組比較(t=12.072)，aP＜0.01，高劑量組與低劑量組比較(t=11.646)abP＜0.01，低劑量組與訓(xùn)練組比較(t=0.642)，bP＞0.05。

組別 只數(shù)NOS訓(xùn)練組低劑量組高劑量組10 10 10 0.376 8±0.059 93a0.362 1±0.040 63b0.135 7±0.019 93a

2.3 各組血清β-淀粉樣蛋白含量比較 高劑量組與低劑量組和訓(xùn)練組比較，血清β-淀粉樣蛋白含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)低劑量組與訓(xùn)練組相比，兩項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3

表3 各組大鼠血清中Aβ含量(±s)

表3 各組大鼠血清中Aβ含量(±s)

注：高劑量組與訓(xùn)練組比較，t=11.692，aP＜0.01，高劑量組與低劑量組比較，t=10.354，P＜0.01，低劑量組與訓(xùn)練組比較，t=0.080，bP＞0.05。

組別 只數(shù) 淀粉樣蛋白(Aβ，pg/mL)訓(xùn)練組低劑量組高劑量組10 10 10 28.926 7±7.933 57a29.219 3±8.402 87b168.97±36.933 57a

2.4 各組海馬組織免疫組化染色檢測(cè) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，附著于神經(jīng)細(xì)胞膜的褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物，高劑量組陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物明顯低于訓(xùn)練組和低劑量組，見(jiàn)圖1。

圖1 丙泊酚對(duì)各組大鼠海馬區(qū)nNOS表達(dá)的影響(40×10)

3 討 論

POCD是指受多種因素影響的麻醉手術(shù)后患者發(fā)生記憶力、定向力、抽象思維等障礙的急性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征，高齡是最為重要的危險(xiǎn)因素，有研究表明老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率高達(dá)30%左右[4]。POCD的病理機(jī)制目前尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為其與阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生可能有共同的病理基礎(chǔ)[5]：其基本的病理學(xué)特征為中樞膽堿能系統(tǒng)功能降低、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和β淀粉樣蛋白聚集[6-7]。

學(xué)習(xí)記憶的重要解剖學(xué)基礎(chǔ)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)，特別是與大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分—海馬關(guān)系密切[8]。海馬區(qū)中合成神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮(NO)進(jìn)而參與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)健酶是神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)；同時(shí)大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)是大腦海馬部位突觸傳遞效能的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)與放大現(xiàn)象(Long-term potentiation，LTP)[9-10]；還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，有些麻醉鎮(zhèn)靜藥導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能受損是恰恰是通過(guò)激活神經(jīng)中樞抑制性遞質(zhì)—氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)受體，從而抑制離體海馬腦片的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)與放大效應(yīng)，并使突觸傳遞的可塑性受到嚴(yán)重影響，進(jìn)一步引起nNOS表達(dá)下降所致[11]。

Aβ是AD細(xì)胞核中老年斑的始動(dòng)因子和主要成分，在大腦Aβ增多與認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切[12]，Aβ可以導(dǎo)致神經(jīng)元間信息傳遞受阻，并引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而引起學(xué)習(xí)記憶障礙。Aβ表達(dá)不僅可致神經(jīng)元突觸功能障礙，還可通過(guò)蛋白激酶和糖原合成酶激酶的激活引起tau蛋白過(guò)度磷酸化，進(jìn)而引起神經(jīng)退行性疾病；Aβ不僅對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有直接的毒性作用導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，其本身也能產(chǎn)生自由基和反應(yīng)性氧化物，通過(guò)損傷膜脂質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[13-14]。大腦Aβ聚集反映血漿中Aβ生成增加，因此血漿中Aβ的濃度改變可以間接反映腦組織中Aβ的聚集情況[15]。麻醉藥物丙泊酚的持續(xù)大劑量應(yīng)用能夠?qū)?dòng)物的認(rèn)知功能造成不良影響，甚至產(chǎn)生術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力的嚴(yán)重受損[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多次重復(fù)腹腔注射高劑量(100 mg/kg)丙泊酚并維持麻醉后，老年SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能受損，高劑量組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，海馬區(qū)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和積分光密度值(IOD)明顯低于訓(xùn)練組和低劑量組，血清β-淀粉樣蛋白含量顯著增多，這種損傷程度與丙泊酚的劑量相關(guān)。

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Effects of propofol on cognitive function,hippocampus nNOS and serum amyloid β-protein in aged rats.

ZHANG Huan,YUAN Tao,SHI Yan-jie.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Liaoning Chinese Medicine Uiversity; Department of Anesthesiology,Third Affiliated Hospital of Shenyang Medical College,Shenyang 110032,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of propofol on learning and memory of elderly rats and its possible mechanism.MethodsThirty Sprague-Dawley(SD)rats(average age,12 months)were chosen and randomly assigned to one of three groups(n=10 for each group):training group,propofol low dose group and high dose group.24 hours after anesthesia,no fixed number of random training method was used for behavioral tests in the water maze for five days,and the escape latency and the number of across the platform were recorded.After behavioral tests were finished,the blood was drawn,after which the rats were immediately killed by decapitation.Then,the expression of nitric oxide synthase(nNOS)in the hippocampus area of brain tissue and the content of serum amyloid β-protein were detected by immunohistochemical staining method.ResultsThe behavioral tests in water maze showed that compared with training group,propofol high dose group had the significantly longer escape latency and significantly less number of across the platform(t=12.142,t=5.63,respectively,P＜0.01);There was no significant difference between the training group and propofol low dose group in the two same indexes(t=0.38 and 0.773,respectively,P＞0.05).According to the results of immunohistochemical staining,the nNOS positive cells in hippocampus and integral optical density(IOD)of propofol high dose group were significantly lower than those of the propofol low dose group and training group(t= 12.072,t=11.646,respectively,P＜0.01);There was no significant difference between the training group and propofol low dose group in the two same indexes(t=0.642,P＞0.05);Compared with propofol low dose group and training group, the amyloid β-protein content in propofol high dose group significantly increased(t=11.692 and 10.354,respectively P＜0.01);There was no significant difference between propofol low dose group and training group in the amyloid β-protein content(P＞0.05,t=0.082).ConclusionAnesthesia using multiple high dose injection of propofol can induce and maintain the damage on learning and memory function of elderly rats,which has the close relationship with the inhibition degree of hippocampus nNOS expression and the content of Serum amyloid β-protein.

Propofol;Aged rats;Cognitive function;Nitric oxide synthase(nNOS);Serum amyloid β-protein

R-332

A

1003—6350（2016）10—1554—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.002

2016-01-12)

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào)：L2013378)

苑韜。E-mail：ytshy@sohu.com