汪　露，　江　濤

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016)

?

外周血Th17細胞對慢性阻塞性肺疾病癥狀嚴重程度及預(yù)后的評估價值*

汪露，江濤△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016)

[摘要]目的： 觀察Th17細胞水平與慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者癥狀嚴重程度及預(yù)后因素的相關(guān)性，以期探討Th17細胞水平在判斷COPD臨床預(yù)后方面的可能價值。方法: 選取2013年5月～2014年12月我院就診的110例COPD患者為研究對象，40例健康體檢者為對照組。根據(jù)COPD全球倡議(GOLD)將COPD患者分為A組(低危、癥狀輕)、B組(低危、癥狀重)、C組(高危、癥狀輕)及D組(高危、癥狀重)，給予吸入性糖皮質(zhì)激素/長效β2受體激動劑或吸入性糖皮質(zhì)激素/長效β2受體激動劑+長效膽堿能藥物治療，收集患者治療前及治療3個月后相關(guān)臨床資料，包括外周血Th17細胞比例、細胞因子(IL-17和IL-6)、慢性阻塞性肺疾病評估測試(CAT)評分、年齡、體重指數(shù)、肺功能指標及診斷前12個月COPD急性加重(AECOPD)次數(shù)，分析Th17細胞水平與其它臨床特征間的相關(guān)性。結(jié)果: COPD患者外周血Th17細胞、IL-17及IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)。隨著COPD癥狀嚴重程度的增加，B、D組COPD患者外周血Th17細胞、細胞因子(IL-17和IL-6)水平及CAT評分顯著高于A、C組患者(P<0.05)。單變量相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，治療前B、D組外周血Th17細胞水平與CAT評分呈正相關(guān)(P<0.05)，而與FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred呈負相關(guān)(P<0.05)；A、C組外周血Th17細胞水平與CAT評分、FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred無明顯相關(guān)性。治療后外周血Th17細胞水平與CAT評分呈正相關(guān)(P<0.05)，而與FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論: 外周血Th17細胞水平與COPD患者IL-17、IL-6、CAT評分及肺功能指標有較好的相關(guān)性，具有評估COPD患者癥狀嚴重程度及預(yù)后的潛在臨床價值。

[關(guān)鍵詞]Th17細胞； 慢性阻塞性肺疾病； 肺功能； 白細胞介素17

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstruction pulmonary disease，COPD)是各種炎癥細胞參與的全身異常炎癥反應(yīng)性疾病，以不完全可逆的氣流受限為主要特點[1]。其發(fā)病率高，預(yù)后差，嚴重威脅患者身體健康，同時給患者及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，如何早期預(yù)測其病情嚴重程度及預(yù)后，進而針對COPD患者進行個體化治療，具有重要的臨床意義。相關(guān)研究證實，中性粒細胞的募集與活化是COPD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素之一[2]。輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)是近些年發(fā)現(xiàn)的一類淋巴細胞亞群，在多種免疫及感染性疾病中起著重要的作用，其特異性分泌的細胞因子(IL-17)可誘導(dǎo)機體組織損傷，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。Th17細胞是否與COPD的癥狀嚴重程度及預(yù)后有關(guān)，目前，相關(guān)研究尚未闡明。因此，本研究通過檢測COPD患者外周血Th17及IL-17水平，并分析Th17細胞與肺功能指標的相關(guān)性，以期探討Th17細胞在預(yù)測COPD患者癥狀嚴重程度及預(yù)后評價的臨床價值。

材料和方法

1研究對象

選取2013年5月～2014年12月到我院呼吸內(nèi)科就診的COPD患者110例，男68例，女42例，年齡48歲～75歲，平均年齡63歲，所有患者均符合COPD診斷標準[4]。排除標準：合并有其它肺部疾病或感染者；存在免疫缺陷的患者；合并有其它系統(tǒng)疾病如心、肝、腦、腎等嚴重功能障礙；近1個月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素的患者；不愿意配合及不能交流的患者。同時選取我院門診的健康體檢者40例為正常對照組，其中男性25例，女性15例，年齡47歲～74歲，平均年齡62歲。COPD組與對照組間在性別、年齡方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準，并且所有患者均簽署了知情同意書。

2主要儀器與試劑

流式細胞分析儀(BD)；RPMI-1640培養(yǎng)液及胎牛血清(Gibco)；高速離心機(Beckman)；肺功能儀(SensorMedics)；佛波酯、離子霉素及莫能菌素(Sigma)；抗人CD4-FITC單克隆抗體及抗人IL-17-PE單克隆抗體(eBioscience)；人細胞因子IL-17及IL-6 ELISA試劑盒(中國博士德公司)。

3方法

3.1肺功能檢測對COPD患者進行常規(guī)肺功能檢測，檢測操作參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會肺功能檢查操作規(guī)范進行。肺功能檢測指標包括：第1 s用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、FEV1占預(yù)計值百分比(FEV1%Pred)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)及FVC占預(yù)計值百分比(FVC%Pred)。

3.2COPD評估測試(COPD assessment test,CAT)評分方法CAT問卷主要包括 8 個問題(咳嗽、咳痰、胸悶、爬坡或上一層樓梯的感覺、家務(wù)活動、離家外出信心程度、睡眠和精力)?；颊邞?yīng)根據(jù)自身情況，對上述每個項目做出相應(yīng)評分，每個問題應(yīng)根據(jù)病情從輕到重依次為0～5分。計算總分，CAT分值范圍是0～40分。得分為0～10分的患者為COPD“輕微影響”，11～20者為“中等影響”，21～30分者為“嚴重影響”，31～40分者為“非常嚴重影響”。

3.3COPD患者分組收集COPD患者CAT評分、肺功能指標及診斷前12個月COPD急性加重(acute exacerbation of COPD,AECOPD)次數(shù)3個方面相關(guān)臨床資料。根據(jù)慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD 2011)指南[5]，將他們分為A、B、C、D共4組，其中A組(29例)表示患者低危且癥狀輕；B組(30例)表示患者低危但癥狀重；C組(24例)表示患者高危但癥狀輕；D組(27例)表示高危且癥狀重。A、B組患者給予50 μg沙美特羅及500 μg丙酸氟替卡松治療，一日2次； C、D組患者給予50 μg沙美特羅和500 μg丙酸氟替卡松，一日2次，加上18 μg噻托溴銨治療，一日1次。各組均治療3個月。

3.4外周血Th17細胞檢測收集COPD組治療前后及對照組清晨空腹靜脈血3 mL，經(jīng)肝素抗凝及加入等體積淋巴細胞分離液后離心，1 500 r/min 15 min，得到外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)懸液，采用血球計數(shù)板計算PBMC數(shù)量。12孔板培養(yǎng)PBMC，每孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基1 mL，佛波酯(50 μg/L)、離子霉素(1 mg/L)及莫能菌素(0.7 mg/L)吹打混勻，孵育4 h。加入抗人CD4單抗20 μL，室溫避光孵育20 min。再通過加入染色緩沖液2 mL及抗IL-17單抗20 μL，室溫孵育15 min，此后離心1 500 r/min 10 min，棄上清，加入染色固定液1 mL，等待上機檢測。

3.5ELISA檢測血漿IL-6和IL-17的含量采用ELISA法檢測COPD組治療前后及對照組外周血IL-6和IL-17水平，整個操作按試劑盒說明步驟進行。簡要操作步驟如下：取出酶標板，確定其酶標板數(shù)目，分別加入標準品和待測樣本，在室溫條件下，孵育1 h。PBS洗板3次，然后加入酶標工作液100 μL，室溫孵育1 h。再次PBS洗板3次，加入顯色劑A液100 μL和顯色劑B液100 μL，室溫避光條件下，孵育30 min。PBS洗板3次，加入終止液100 μL后，在酶標儀上測量各組A450值。繪制其標準曲線，計算各組樣本IL-6和IL-17的水平。

4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析及處理。計量資料數(shù)據(jù)以均值±標準差(mean±SD)表示，各組間差異性比較進行方差齊性檢驗。兩組間比較采用t檢驗，而多組間比較運用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用Graphpad軟件做ROC曲線，計算ROC曲線下面積及最佳工作點。

結(jié)果

1COPD組與對照組外周血Th17及細胞因子水平

與正常對照組相比，COPD組患者外周血Th17細胞及IL-17、IL-6顯著高于對照組(P<0.05),見圖1、表1。

Figure 1.The Th17 cell levels in the 2 groups were measured by flow cytometry.

圖1流式細胞術(shù)檢測2組間Th17細胞比例

表12組外周血Th17及細胞因子水平

Table 1.The levels of Th17 and cytokines in the 2 groups (Mean±SD)

GroupnTh17(%)IL-17(ng/L)IL-6(ng/L)Control401.1±0.510.7±2.85.8±1.6COPD1106.9±1.6*39.4±7.2*18.9±3.2*

*P<0.05vscontrol group.

2不同COPD危重組間外周血Th17、細胞因子水平及肺功能的比較

B、D組COPD患者吸煙指數(shù)較A、C組明顯增高(P<0.05)。隨著癥狀嚴重程度的增加，B、D組COPD患者外周血Th17細胞、細胞因子(IL-17和IL-6)水平及CAT評分顯著高于A、C組患者(P<0.05)。B、C、D組患者肺功能指標FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred較A組降低(P<0.05)。C組、D組AECOPD次數(shù)顯著較A、B組增加(P<0.05)。各組間在性別、年齡及體重指數(shù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3治療前后COPD患者外周血Th17、細胞因子水平、CAT評分及肺功能比較

與治療前相比，COPD患者治療后外周血Th17細胞、IL-17、IL-6和CAT評分明顯降低(P<0.05)。與治療前相比，COPD患者治療后肺功能指標FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred明顯較治療前改善(P<0.05)，見表3。

4相關(guān)性分析

處周血Th17細胞水平與各臨床指標之間的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。

表2　不同COPD危重組患者的臨床特征

*P<0.05vsgroup A.

表3COPD患者治療前后相關(guān)臨床特征比較

Table 3.The clinical characteristics of COPD patients before and after treatment

ItemBeforetreatmentAftertreatmentTh17(%)6.9±1.63.2±0.5*IL-17(ng/L)39.4±7.229.2±6.9*IL-6(ng/L)18.9±3.211.7±2.8*CATscore14.3±3.77.2±1.3*FEV1(V/L)1.5±0.32.0±0.4*FEV1%Pred66.8±8.680.4±9.0*FVC(V/L)2.5±0.33.4±0.4*FVC%Pred83.4±5.595.3±6.8*

*P<0.05vsbefore treatment.

表4外周血Th17細胞水平與各臨床指標之間的相關(guān)性

Table 4.The correlation between peripheral Th17 cell level and clinical indicators

ItemTh17(%)beforetreatmentTh17(%)aftertreatmentrPrPIL-17(ng/L)0.6820.0120.8520.005IL-6(ng/L)0.7230.0090.9420.003CATscore0.4720.0280.5230.015FEV1(V/L)-0.3640.023-0.4820.012FEV1%Pred-0.5230.011-0.5730.011FVC(V/L)-0.4620.013-0.6960.008FVC%Pred-0.3150.025-0.4340.014

5外周血Th17細胞水平對COPD患者癥狀嚴重程度診斷的ROC曲線分析

通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)外周血Th17細胞水平的曲線下面積(AUC)為0.871，其最佳工作點(OOP)為7.1 %，提示外周血Th17細胞比例>7.1 %，此時判斷COPD癥狀嚴重程度的精確率較高(敏感性為81.42%，特異性為87.50%)，見圖2。

Figure 2.The ROC curves of peripheral Th17 cell level.

圖2外周血Th17細胞水平的ROC曲線

討論

COPD主要表現(xiàn)為不完全性可逆氣流受限，病情常進行性加重，嚴重威脅患者身體健康。目前，COPD的發(fā)病率及死亡率均較高，雖然其確切的發(fā)病機制仍不太清楚，但大量的研究已顯示，反復(fù)的氣道慢性炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[6]。Th17是一類近些年來發(fā)現(xiàn)的淋巴細胞亞群，其主要分泌IL-17，發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)。相關(guān)研究證實，在自身免疫性疾病及炎癥性疾病中，特別是膿毒癥患者中，其外周血中Th17細胞比例及IL-17明顯高于健康對照者，并且隨著疾病嚴重程度的加重，Th17細胞數(shù)量及IL-17水平也明顯增加[7]?？梢姡琓h17細胞的活化是促進炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。已有研究顯示，COPD患者外周血中Th17細胞數(shù)量及IL-17水平較正常對照者顯著升高[8]，提示Th17在COPD的發(fā)病過程中起著重要的作用，但是否Th17與COPD的癥狀嚴重程度及預(yù)后有關(guān)，目前相關(guān)研究尚未闡明。針對COPD患者尋找一項指標，有效的評估其癥狀嚴重程度及預(yù)后，對于臨床進一步干預(yù)治療具有重要的意義。在本研究中，通過檢測COPD患者外周血Th17及IL-17水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與以往研究報道一致，COPD患者外周血Th17及IL-17水平較正常對照者明顯升高。進一步根據(jù)COPD患者CAT評分、肺功能指標及診斷前12個月AECOPD次數(shù)3個方面對其癥狀嚴重程度進行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著癥狀嚴重程度的增加，其外周血Th17、IL-17及IL-6水平也明顯增加。相關(guān)分析顯示，COPD患者癥狀嚴重組其外周血Th17細胞比例與肺功能呈負相關(guān)，而與CAT評分呈正相關(guān)，說明COPD外周血Th17細胞比例越高，肺功能越差，而相應(yīng)的CAT評分越高。通氣功能及CAT評分是反映COPD患者臨床預(yù)后的重要參考指標[9]。通過進一步做外周血Th17細胞比例ROC曲線分析判斷COPD癥狀嚴重程度，其曲線下面積較大(>0.85)，可作為判斷癥狀嚴重程度的有效指標，其中，Th17細胞比例>7.1 %時對COPD癥狀嚴重度的判斷精確率較高。同時本研究通過給予各組COPD患者相應(yīng)治療后，肺功能較治療前明顯改善，CAT評分明顯降低，提示患者的臨床預(yù)后較好。同時進一步檢測治療后外周血Th17及IL-17水平，結(jié)果顯示，COPD患者治療后其外周血Th17及IL-17明顯較治療前降低，表明外周血Th17可用于評估COPD患者治療效果，判斷其預(yù)后。相關(guān)研究顯示，抑制體內(nèi)Th17細胞及其分泌的IL-17水平，可以明顯降低炎癥反應(yīng)，改善炎癥性疾病患者預(yù)后[10]。針對COPD患者，通過檢測外周血Th17細胞水平，其不僅可作為評判癥狀嚴重程度及預(yù)后的有效指標，還可能為其治療提供新的靶點。

綜上所述，COPD患者外周血Th17細胞水平隨著病情的發(fā)展呈現(xiàn)明顯升高趨勢，能有效地反映癥狀的嚴重程度，同時對預(yù)后也有一定的參考價值。因此，在臨床工作中，可通過檢測Th17細胞水平對COPD患者癥狀嚴重程度及預(yù)后進行評估，同時為進一步的個體化治療提供依據(jù)。

[參考文獻]

[1]Warwick E, Scourfield A, Quint J. Systemic manifestations of chronic obstructive pulmonary disease [J]. Br J Hosp Med (Lond), 2015, 76(6):324-329.

[2]Usher AK, Stockley RA. The link between chronic periodontitis and COPD: a common role for the neutrophil? [J]. BMC Med, 2013, 11:241.

[3]黃雪瓊，檀衛(wèi)平，吳葆菁，等. 骨髓間充質(zhì)干細胞對重癥哮喘患兒外周血Th17/Treg的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(9): 1694-1697,1702.

[4]中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組. 慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版) [J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版, 2014, 6(2):67-80.

[5]Vestbo J, Hurd SS, Agustí AG, et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(4):347-365.

[6]Barker BL, McKenna S, Mistry V, et al. Systemic and pulmonary inflammation is independent of skeletal muscle changes in patients with chronic obstructive pulmonary di-sease[J]. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis, 2014, 9:975-981.

[7]Li J, Li M, Su L, et al. Alterations of T helper lymphocyte subpopulations in sepsis, severe sepsis, and septic shock: a prospective observational study[J]. Inflammation, 2015, 38(3):995-1002.

[8]Li H, Liu Q, Jiang Y, et al. Disruption of Th17/Treg balance in the sputum of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Med Sci, 2015, 349(5):392-397.

[9]Ohno T, Wada S, Hanada S, et al. Efficacy of indacaterol on quality of life and pulmonary function in patients with COPD and inhaler device preferences[J]. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis, 2014, 9:107-114.

[10]Podolin PL, Foley JP, Carpenter DC, et al. T cell depletion protects against alveolar destruction due to chronic cigarette smoke exposure in mice [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2013, 304(5):L312-L323.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Diagnostic value of Th17 cells in symptom severity and prognosis of chronic obstructive pulmonary diseaseWANG Lu, JIANG Tao

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:jiangtaocq01@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To observed the correlation between Th17 cell level and the symptom severity and prognostic factors of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and to explore the clinical application value of Th17 cell level in assessing the prognosis of patients with COPD. METHODS: The patients with diagnosed COPD (n=110) in our hospital during May 2013 to December 2014, and 40 healthy subjects were enrolled in the study. According to the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD), the COPD patients were divided into group A (low risk, less symptoms), group B (low risk, more symptoms), group C (high risk, less symptoms) and group D (high risk, more symptoms), which were given inhaled corticosteroid/long-acting β2agonist or corticosteroid/long-acting β2agonist+long-acting antimuscarinic agent treatment for 3 months. The proportion of Th17 cells, cytokines (IL-17 and IL-6), the COPD assessment test (CAT) score, age, body mass index, pulmonary function and the times of acute exacerbation of COPD in previous 1 year were observed before and after treatment. The correlation analysis between the level of Th17 cells and other clinical characteristics was performed. RESULTS: Th17 cell, IL-17 and IL-6 levels in COPD group were significantly higher than those in control group (P<0.05). With the increase in the severity of COPD symptoms, Th17 cells, cytokines (IL-17 and IL-6) and CAT score in groups B and D were significantly higher than those in groups A and C (P<0.05). The univariate analysis showed that the levels of Th17 cells in groups B and D before treatment were positively correlated with the CAT score (P<0.05), which were negatively correlated with FEV1, FEV1% Pred, FVC and FVC% Pred. The levels of Th17 cells were not correlated with the CAT score, FEV1, FEV1% Pred, FVC and FVC% Pred in groups A and C. The levels of Th17 cells after treatment were positively correlated with the CAT score, which were negatively correlated with FEV1, FEV1% Pred, FVC and FVC% Pred (P<0.05). CONCLUSION: The peripheral Th17 cell level has a good correlation with IL-17, IL-6, CAT score and pulmonary function in COPD patients, suggesting a potential value to predict the symptom severity and prognosis of COPD.

[KEY WORDS]Th17 cells; Chronic obstructive pulmonary disease; Pulmonary function; Interleukin-17

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.014

[中圖分類號]R563； R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 023-89012704; E-mail: jiangtaocq01@163.com

*[基金項目]國家臨床重點?？茖ｍ椊?jīng)費資助課題(No. 2012-649)

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2015- 10- 19

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0273- 05