田 敏,張 改

(西安工業(yè)大學(xué) 材料與化工學(xué)院,西安 710021)

酰胺類氮氧自由基的合成及輻射防護性能研究

田 敏,張 改

(西安工業(yè)大學(xué) 材料與化工學(xué)院,西安 710021)

針對氮氧自由基類化合物清除體內(nèi)有害自由基，有效防護輻射損傷，文中將4-醛基苯甲酸酰氯化，與手性試劑S-1-甲基苯乙胺縮合、最后與雙羥胺縮合、氧化，合成了一種酰胺類手性氮氧自由基S-1，經(jīng)EA、IR和MS確證產(chǎn)物結(jié)構(gòu).選擇健康雄性昆明鼠作為研究對象，以陽性對照藥WR2721為參比測定了化合物抗輻射性能.研究結(jié)果表明：中間體S-11合成的最佳反應(yīng)條件為室溫攪拌8 h后回流2 h，S-1-甲基苯乙胺:4-醛基苯甲酰氯最佳配比為1∶2；目標(biāo)產(chǎn)物S-1合成的最佳反應(yīng)條件為回流24 h，NaIO4作為氧化劑；抗輻射性能結(jié)果顯示在6.0 Gyγ、6.5 Gyγ和7.0 Gyγ三種不同輻照劑量新型酰胺類氮氧自由基S-1的抗輻射作用均優(yōu)于陽性對照藥WR2721.

4-醛基苯甲酸;酰胺類氮氧自由基;抗輻射;化學(xué)合成

氮氧自由基是一類包含氮氧自旋單電子的穩(wěn)定有機化合物.作為研究對象，它曾活躍在生物學(xué)[1]、磁學(xué)[2]和光學(xué)[3]等領(lǐng)域，比如作為自旋示蹤劑用于描述細胞膜結(jié)構(gòu)及其功能[4].近年來，它再次引起科學(xué)家的關(guān)注，是由于其在抗輻射領(lǐng)域藥物的貢獻[5].

氮氧自由基抗輻射的原因在于從根本上消除了產(chǎn)生輻射致傷的關(guān)鍵因子—高密度的有害自由基[6]，它可以通過模擬體內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的作用[7]、防止脂質(zhì)體過氧化作用[8]和阻止活性HO·自由基的生成[9]這三種途徑降低過氧化物引發(fā)的有害自由基對機體的損傷，使自由基和有害自由基之間再結(jié)合，從而抑制了芬頓效應(yīng)的產(chǎn)生，對輻射損傷進行防護[10].

基于氮氧自由基的抗輻射作用，本文擬合成一種酰胺類自由基S-1，并研究了三個不同濃度的新型氮氧自由基在三種不同輻照劑量下在小鼠體內(nèi)的抗輻射作用效果，為研發(fā)新型的抗輻射藥物提供實驗依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 試劑和儀器

核磁數(shù)據(jù)所有產(chǎn)品均選擇以DCCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，由Bruker AV-300 NMR spectrometer (400 MHz)型核磁共振儀測定；紅外數(shù)據(jù)由BRUKER TENSOR27型紅外光譜儀測定；所有固體試劑熔點采用XRC-1型數(shù)字顯微熔點儀(溫度計未校正)測定；元素分析數(shù)據(jù)由Perkin-Elemer 240型元素分析儀測定；質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Varian 7.0T ESI-FTICR-MS型質(zhì)譜儀測定；選擇用V(氯仿):V(石油醚)=1∶1的混合溶劑為展開劑，Alugramsilica gel/uv 254薄層板，薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography，TLC)法監(jiān)測反應(yīng)進程；柱分離用粒徑為?0.074～0.049 mm硅膠.雙羥胺自制，醛酸等試劑純度均為化學(xué)純.

1.2 實驗過程

圖1列出S-1的合成過程.

1.2.1 中間體S-10的制備

在250 mL的單口瓶中 加入4-醛基苯甲酸6.00 g(30 mmol)，隨后加入新蒸的80 mL的SOCl2，攪拌待溶解后，室溫再攪拌0.5 h，然后逐漸升溫至回流，薄層板監(jiān)測反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，多余SOCl2溶劑被減壓蒸除，得到淡褐色液體，稱重5.33 g，產(chǎn)率為79%.

圖1 S-1的合成路線

1.2.2中間體S-11的制備

3.60 g(30 mmol)S-1-甲基苯乙胺加入到250 mL的三頸瓶中，加入150 mL處理過的四氫呋喃，攪拌溶解，再加入6.4 mL三乙胺，冰浴下滴加溶有5.06 g(30 mmol)4-醛基苯甲酰氯(上述1.2.1制得)的100 mL THF溶液.滴加完畢后，室溫下攪拌8 h繼續(xù)回流2 h.用(3×50 mL)乙酸乙酯萃取，(2×50 mL)飽和碳酸氫鈉依次洗滌.合并有機相，用無水MgSO4干燥、旋蒸溶劑后得白色針狀固體，用乙醚重結(jié)晶，得產(chǎn)物6.23 g.

1.2.3 自由基S-1的制備

將上述1.2.2產(chǎn)物2.79 g(11.04 mmol)置于100 mL單口瓶中，加入2,3-二羥胺-2,3-二甲基丁烷1.62 g(11.04 mmol)，70 mL 甲醇，攪拌溶解，回流反應(yīng)24 h，蒸除溶劑，在殘渣中加入100 mL CH2Cl2，冰浴攪拌0.5h，滴加溶有NaIO42.13 g(10.05 m·mol-1)的50 mL水溶液，冰浴攪拌2h，反應(yīng)結(jié)束后靜置分層，收集有機相，并用無水Na2SO4干燥，過柱子分離得純品2.19 g.

1.3 酰胺類自由基的抗輻射效果研究

選用雄性健康昆明小鼠作為研究對象，隨機將其按每組20只分為四組：照射對照組、正常對照組、受試藥物組陽性和藥物對照組.照射對照組照前一次給予0.5～1.0 mL的生理鹽水.受試藥物分成3種劑量給藥，照射前30 min給藥組小鼠一次性腹腔或灌胃給藥，每組給藥體積0.5～1.0 mL(5%二甲基亞砜溶解)，照射對照組、受試藥物組陽性和藥物對照組動物接受一次性全身性照射.以十天為一個階段，每天觀察在記錄表上記錄受輻照小鼠的狀況、死亡時間和死亡數(shù)，記錄三階段.從而研究受試藥物對急性放射病小鼠存活率的抗輻射作用影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的表征結(jié)果

S-11為白色晶體，產(chǎn)率為87.5%.選用CH2Cl2為溶劑，濃度為1.1 g·cm-3,計算出比旋光度[a]D20=+67.2; 產(chǎn)物1H NMR以CDCl3為溶劑測出化學(xué)位移δ9.90單峰為 -CHO上的氫,δ8.43雙峰為苯環(huán)上的氫,δ8.28單峰為苯環(huán)上的氫,δ8.12雙峰為苯環(huán)上的氫；δ8.08雙峰為苯環(huán)上的氫；δ7.45-7.18多重峰為苯環(huán)上的峰；δ4.24雙峰為次甲基上的氫；δ1.36雙峰為次甲基上的氫；IR以KBr壓片:3 400 cm-1為仲酰胺N-H伸縮振動峰，2 880 cm-1和2 828 cm-1為醛基C-H伸縮振動峰,1 788 cm-1為醛基C=O伸縮振動峰，1 623 cm-1為酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動峰,1 533 cm-1為酰胺Ⅱ帶N-H面外震動和C-H伸縮振動偶合峰,1 351 cm-1為酰胺Ⅲ帶N-H面外震動和C-H伸縮振動偶合峰,855 cm-1苯環(huán)上兩個鄰接氫的=CH面外變形震動峰,700 cm-1苯環(huán)上五個鄰接氫的=CH面外變形震動峰; 元素分析(C16H15NO2)顯示C(75.84%)、H(5.96%)和N(5.51%)，與計算值C(75.86%)、H(5.97%)和N(5.53%)相符.

S-1為藍色晶體，產(chǎn)率52%.MS顯示分子離子峰m/z為380.92[M+H]+; IR以KBr壓片:1 625 cm-1為酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動峰,1 566 cm-1為酰胺Ⅱ帶N-H面外震動和C-H伸縮振動偶合峰,1 339 cm-1為酰胺Ⅲ帶N-H面外震動和C-H伸縮振動偶合峰,853 cm-1苯環(huán)上兩個鄰接氫的=CH面外變形震動峰,698 cm-1苯環(huán)上五個

鄰接氫的=CH面外變形震動峰; 元素分析(C22H26N3O3):C(69.11%)、H(7.36%)、 N(11.01%)，與計算值C(69.09%)、 H(7.38%)、N(10.99%)相符.

2.2 中間體S-11合成的影響因素分析

2.2.1 時間對產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)率的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，在合成過程中，反應(yīng)時間對產(chǎn)物中間體S-11產(chǎn)率的影響非常明顯，回流使得反應(yīng)速率得到很大提升，但回流時間不需要太長，時間過長反應(yīng)速率增加不明顯.由表1可知，室溫攪拌8 h后回流2 h的產(chǎn)率最高，即為S-11合成的最佳反應(yīng)時間.

表1 反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響

2.2.2 反應(yīng)物配比對反應(yīng)的影響

實驗發(fā)現(xiàn)不同的反應(yīng)配比對產(chǎn)物影響很大，考察了反應(yīng)物S-1-甲基苯乙胺與4-醛基苯甲酰氯不同配比對產(chǎn)物產(chǎn)率的影響.如圖2所示.

圖2 反應(yīng)配比對產(chǎn)率的影響

由圖2可知，當(dāng)比值低于1∶2時，因原料濃度過低，反應(yīng)緩慢，隨著4-4-醛基苯甲酰氯的用量的增大， S-11的產(chǎn)率增大幅度較大.當(dāng)4-醛基苯甲酰氯的摩爾百分比等于66.7%，即S-1-甲基苯乙胺∶4-醛基苯甲酰氯等于1∶2時產(chǎn)率達到最大.當(dāng)配比超過1∶2之后在薄層板上二取代產(chǎn)物點明顯增加，產(chǎn)率增加不明顯，由圖2可知，4-醛基苯甲酰氯的最佳摩爾百分比為66.7%，即S-1-甲基苯乙胺∶4-醛基苯甲酰氯為1∶2，配比最佳.

2.3 目標(biāo)產(chǎn)物S-1合成的影響因素分析

2.3.1 時間對產(chǎn)率的影響

實驗發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間對產(chǎn)物S-1產(chǎn)率影響很大，以甲醇做溶劑回流反應(yīng)6 h后反應(yīng)瓶中有白色沉淀的產(chǎn)生，24 h后白色沉淀不再增加，可知最佳反應(yīng)時間為24 h.

圖3 反應(yīng)時間對S-1產(chǎn)率的影響

2.3.2 氧化體系對產(chǎn)率的影響

二羥基咪唑的氧化文獻中通常選用的氧化劑是PhO2和NaIO4.二氧化鉛體系氧化劑用量較大、反應(yīng)時間相對較長，反應(yīng)過程因二氧化鉛本身為褐色而難以觀察反應(yīng)進程，薄層板監(jiān)測反應(yīng)，產(chǎn)物點濃度很低，副產(chǎn)物較多，后處理麻煩.而NaIO4作為氧化劑時，通過控制反應(yīng)溫度和監(jiān)測反應(yīng)進程，可以較高產(chǎn)率得到目標(biāo)產(chǎn)物.

2.4 目標(biāo)化合物抗輻射活性

將生理鹽水組、受試藥物組(三個濃度劑量0.1 mmol·kg-1、0.25 mmol·kg-1、0.5 mmol·kg-1)陽性對照藥(0.5 mmol·kg-1)接受6.0 Gyγ射線照射見表2.由表2可知隨著各個階段天數(shù)的增加，未受藥物保護的正常小鼠由于受到輻射損傷，小鼠的存活率逐漸減少，因輻射劑量較小，服用陽性對照藥的小鼠和服用三種不同濃度的受試藥物基本均未受到輻射損傷，結(jié)果顯示出S-1的初步藥效.表3中輻射劑量提升至6.5 Gy，受γ射線照射的小鼠存活率受到影響，均有不同程度明顯的下降，而接受S-1藥物的小鼠降低幅度明顯比陽性對照藥WR2721降低的幅度小，顯示出了優(yōu)于陽性藥物的抗輻射作用效果.為了觀察受試藥的進一步藥效，我們把劑量提升至7.0 Gy(見表4)時，小鼠存活率減少幅度都增大，S-1降低幅度仍然小于WR2721陽性對照藥.以上結(jié)果顯示S-1的抗輻射作用比陽性對照藥WR2721作用更好.

表2 在6.0 Gyγ射線下不同濃度的S-1對雄性昆明小鼠生存率影響

注：每組20只小鼠，#是指與正常組比較，P<0.05，*是指與生理鹽水組比較，P<0.05.

表3 在6.5 Gyγ射線下不同濃度的S-1對雄性昆明小鼠生存率影響

注：每組20只小鼠，#是指與正常組比較，P<0.05，*是指與生理鹽水組比較，P<0.05.

表4 在7.0 Gyγ射線下不同濃度的S-1對雄性昆明小鼠生存率影響

注：每組20只小鼠，#是指與正常組比較，P<0.05，*是指與生理鹽水組比較，P<0.05.

3 結(jié) 論

1) 通過四步合成了一種酰胺類氮氧自由基S-1，并通過IR，1HNMR，質(zhì)譜等對其結(jié)構(gòu)進行表征.每組選擇20只健康雄性昆明鼠做為研究對象，與陽性對照藥物WR2721進行了比較，在6.0 Gyγ、6.5Gyγ和7.0 Gyγ三個不同輻射強度下對其存活率進行了研究.

2)通過分析中間體S-11合成時間對產(chǎn)率的影響，得到最佳反應(yīng)時間室溫攪拌8 h后回流2 h.通過分析中間體S-11合成中S-1-甲基苯乙胺和4-醛基苯甲酰氯不同配比對產(chǎn)率的影響，得到最佳配比S-1-甲基苯乙胺:4-醛基苯甲酰氯為1∶2.

3) 通過分析目標(biāo)產(chǎn)物S-1合成時間對產(chǎn)率的影響，得到最佳反應(yīng)時間24 h.通過分析目標(biāo)產(chǎn)物S-1合成中不同氧化劑對產(chǎn)率的影響，選擇NaIO4作為氧化劑.

4) 綜合三組生物體外活性實驗，結(jié)果顯示：S-1有較好的抗輻射作用，比陽性對照藥WR2721抗輻射作用好，可以作為新型的抗輻射藥物來研究.

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(責(zé)任編輯、校對 潘秋岑)

Synthesis of a New Amide Nitroxide and Its Radioprotective Effect

TIANMin,ZHANGGai

(School of Materials and Chemical Engineering,Xi’an Technological University,Xi’an 710021,China)

Based on scavenging harmful free radicals in vivo of nitrogen oxygen free radicals,a new amide free radical was synthesized by the acetylation of the aldehyde acid and the condensation of S-1-phenylethylamine and double hydroxylamine.The product was characterized by the techniques of EA,IR and MS.The optimum conditions for synthetic reaction are as follows.For intermediates S-11,the optimum condition is stirring at room temperature for 8hs and refluxing for 2hs,with the mass ratio of S-1-methyl phenethylamine to 4 aldehyde benzoyl chloride being 1∶2.For S-1,the optimum condition is stirring and refluxing for 24 hs ,with NaIO4as an oxidant.The effect of the radiation protection in vivo was studied through the experiment on healthy male Kunming mice.The result shows that the anti-radiation activity of the new amide free radical is better than that of WR2721.

the aldehyde acid;chiral nitroxides;anti-radiation activity;chemical synthesis

10.16185/j.jxatu.edu.cn.2016.11.001

2016-05-19 基金資助：國家自然科學(xué)青年基金(21501139 )，西安工業(yè)大學(xué)材料與化工學(xué)院科研項目培育基金

田 敏(1978-)，女，西安工業(yè)大學(xué)講師，主要研究方向為有機化合物的合成及性能研究.E-mail:tiannminn@163.com.

O626.23

A

1673-9965(2016)11-0861-05