錢文俊　岳　川　曹紅利　郝心愿　王　璐　王玉春黃玉婷　王　博　王新超　肖　斌　楊亞軍,*西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院, 陜西楊凌 700;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 國家茶樹改良中心 / 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江杭州 30008

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茶樹中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因CsINV10的克隆與表達(dá)分析

錢文俊1,2岳川2曹紅利2郝心愿2王璐2王玉春1,2黃玉婷2王博2王新超2肖斌1,*楊亞軍1,2,*
1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院, 陜西楊凌 712100;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 國家茶樹改良中心 / 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江杭州 310008

摘要:基于課題組前期對(duì)茶樹冷馴化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果, 從中挑選出6條與中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因高度相似的EST序列, 電子拼接和RT-PCR驗(yàn)證后獲得一條全長(zhǎng)為2101 bp的核酸序列。該基因包含1923 bp的ORF, 編碼640個(gè)氨基酸, 蛋白分子量為71. 8 kD, 理論等電點(diǎn)為5.69。根據(jù)BlastX同源性比對(duì)顯示, 該基因與荔枝LcNI相似性最高(80%), 為G100家族成員, 屬于中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因, 將其命名為CsINV10 (GenBank登錄號(hào)為KT359348)。對(duì)CsINV10氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示, 其與木薯MeNINV8親緣關(guān)系最近。進(jìn)一步分析顯示, CsINV10的氨基酸序列無N端信號(hào)肽, 無跨膜結(jié)構(gòu)域, 屬于親水性蛋白, 并定位在葉綠體上。熒光定量PCR分析表明, CsINV10具有組織表達(dá)特異性, 在茶樹葉和花中的表達(dá)量最高, 根系中最低。分析發(fā)現(xiàn), 低溫(4℃)、干旱和鹽脅迫分別處理茶樹1 d后, 成熟葉片中CsINV10的表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì); 而在ABA條件處理下, 該基因呈先升高后降低趨勢(shì), 在處理5 d后基本不表達(dá), 表明該基因可能參與茶樹對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng), 這為后續(xù)進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化酶基因在茶樹抗寒等逆境脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:茶樹; 中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因; 定量分析

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170650), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-23), 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY14C160001),浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(xiàng)(2012C2905-3)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31170650), the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-23), the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY14C160001), the Major Project for New Agricultural Varieties Breeding of Zhejiang Province (2012C2905-3) and the Chinese Academy of Agricultural Sciences through an Innovation Project for Agricultural Sciences and Technology (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: jajyqian9066@mail.tricaas.com

蔗糖作為非還原型雙糖, 在大多數(shù)植物中基于異養(yǎng)型組織的生理和生化需要, 被運(yùn)送到不同的亞細(xì)胞區(qū)域, 水解為葡萄糖和果糖, 參與到三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中, 以維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境脅迫的抗性。雙糖中的碳可用于生物合成原初代謝, 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育非常重要。同樣, 蔗糖可能轉(zhuǎn)化為聚合物, 如淀粉、三酸甘油酯或多肽用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存; 或者形成次級(jí)化合物使植物能夠適應(yīng)各種生物和非生物逆境脅迫[1]。蔗糖作為碳水化合物和能量的來源, 關(guān)鍵在于其能夠水解為己糖, 在植物中主要靠?jī)深愓崽撬饷竵泶呋@一反應(yīng): (i)蔗糖合成酶(Suc, EC2.4.1.13), 是一類糖基轉(zhuǎn)移酶, 能夠可逆水解蔗糖形成尿苷二磷酸葡萄糖和果糖, 主要在器官成熟過程中參與維持庫強(qiáng)的穩(wěn)固和合成庫產(chǎn)物方面起作用; (ii)轉(zhuǎn)化酶(INV, EC3.2.1.26), 能夠不可逆地將蔗糖水解為葡萄糖和果糖, 在蔗糖分布和調(diào)控“庫—源”關(guān)系方面具有十分重要的作用[2-4], 同時(shí),該類酶能廣泛參與調(diào)控植物生長(zhǎng)、信號(hào)響應(yīng)、原初碳代謝和逆境脅迫響應(yīng)等方面[5-8]。

根據(jù)不同的細(xì)胞定位, 轉(zhuǎn)化酶可以分為胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase, CIN)、液泡轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase, VIN)和細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase, CWIN)三類, 其中CIN又可分為α和β亞族, α亞族主要定位于細(xì)胞器, 如線粒體和葉綠體; β亞族則主要定位于核內(nèi)。而根據(jù)其生化活性和pH的不同又可分為酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase, AI)和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶(alkaline/neutral invertase, A/N-Inv)[9],前者pH在5.0左右時(shí)有較高的酶活性, 而后者pH 6.5～8.0左右時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)化酶活性。A/N-Inv還存在2種不同的異構(gòu)體, 最佳酶活pH為6.5時(shí)為中性轉(zhuǎn)化酶, pH為8.0時(shí)為堿性轉(zhuǎn)化酶[10]。

目前, 關(guān)于轉(zhuǎn)化酶在植物中作用的研究已經(jīng)非常廣泛, 特別是對(duì)酸性轉(zhuǎn)化酶的研究, 涉及到酸性轉(zhuǎn)化酶對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、開花結(jié)果、生物和非生物逆境脅迫響應(yīng)等各方面[11-18]。然而, 由于A/N-Inv并未被糖基化, 蛋白很難純化, 具有不穩(wěn)定性和較低的酶活性, 使得目前關(guān)于這類酶的研究較之酸性轉(zhuǎn)化酶少。近年來, 陸續(xù)在胡蘿卜[4]、小麥[10]、擬南芥[19]、水稻[20]、葡萄[21]、楊樹[22]、百脈根[23]、甘蔗[24]、番茄[25]、木薯[26]等中克隆出A/N-Inv基因。最近的研究表明, A/N-Inv在植物生長(zhǎng)和發(fā)育、能量代謝、碳水化合物平衡和環(huán)境脅迫響應(yīng)方面也發(fā)揮著重要作用[10, 27-30]。借助于植物中的A/N-Inv基因突變, 證明A/N-Inv基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。例如, 在擬南芥中有研究表明A/N-Inv功能的喪失能夠降低根系原初生長(zhǎng)[28,31], 另外, 敲除擬南芥葉綠體中一個(gè)At-A/N-InvE能夠降低擬南芥中A/N-Inv活性, 并且在突變體植株中既檢測(cè)不到A/N-Inv活性也檢測(cè)不到含有A/N-Inv蛋白, 同時(shí)還伴隨著淀粉含量的減少[27]。在水稻中突變一個(gè)與擬南芥同源的A/N-Inv基因OsCyt-inv1會(huì)導(dǎo)致水稻突變體根系變短, 推遲開花和部分不育, 然而通過外源施用葡萄糖又能修復(fù)根系的生長(zhǎng)[32]。相似地, 在百脈根中將一個(gè)A/N-Inv基因LjINV2突變后發(fā)現(xiàn)其A/N-Inv活性和表型都不受影響, 然而, 對(duì)另一個(gè)A/N-Inv基因LjINV1突變處理發(fā)現(xiàn), 其能夠降低A/N-Inv活性, 且極大降低根系和莖干生長(zhǎng), 同時(shí)阻遏花粉形成和損害開花。有趣的是, 這種突變體能夠形成功能性根瘤, LjINV1對(duì)植物整體生長(zhǎng)具有重要作用, 但對(duì)莖節(jié)的形成和功能卻并不重要[23]。然而, 目前依然未知A/N-Inv是如何調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng), 同時(shí), 有關(guān)A/N-Inv基因在響應(yīng)植物逆境方面的作用研究也報(bào)道較少。

茶樹作為多年生常綠葉用植物, 其生長(zhǎng)和分布受到溫度、光照、土壤、水分等多種環(huán)境因子的影響, 其中溫度是限制茶樹自然分布和產(chǎn)量的主要因素。近年來, 茶樹低溫危害成為茶葉生產(chǎn)最常見的環(huán)境逆境, 嚴(yán)重影響了茶葉的產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益。為此, 如何提高茶樹抗寒性以抵御低溫傷害已是近幾年眾多研究者們所關(guān)注的熱點(diǎn)問題。眾多研究表明,植物抗寒性的提高需要經(jīng)過一定時(shí)間和程度的低溫冷馴化才能表現(xiàn)出來[33]。Wang等[34]對(duì)冷馴化條件下的茶樹進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組全局分析發(fā)現(xiàn), 茶樹在冷馴化條件下總共有1770個(gè)差異表達(dá)基因, 這些差異基因主要包括低溫感應(yīng)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因

子基因、滲透響應(yīng)相關(guān)基因等, 此外, 通過對(duì)這些基因的KEGG途徑搜索發(fā)現(xiàn), 碳水化合物代謝途徑和鈣離子信號(hào)途徑在茶樹響應(yīng)低溫脅迫方面起主要作用。Yue等[35]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 隨著茶樹的冷馴化,茶樹成熟葉中的可溶性糖含量逐漸增加, 其中蔗糖(Suc)、葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)和半乳糖(Gal)的含量在抗寒性階段達(dá)到最大, 隨著脫馴化又逐漸降低;且蔗糖等的含量變化與茶樹抗寒能力密切相關(guān)。A/N-Inv作為蔗糖水解的關(guān)鍵酶類, 其在茶樹冷馴化誘導(dǎo)抗寒性方面也可能起重要作用, 但關(guān)于該類基因在茶樹中的研究報(bào)道較少。本研究在課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上, 拼接克隆一個(gè)CsINV10,通過對(duì)該基因生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的研究,旨在為深入研究A/N-Inv在響應(yīng)茶樹逆境脅迫方面的作用和探索冷馴化誘導(dǎo)茶樹抗寒的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

試驗(yàn)材料為2年生國家級(jí)茶樹良種龍井43扦插苗, 種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地。試驗(yàn)試劑主要有SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real-time)試劑盒、Prime Script RT Reagent Kit、克隆載體pMD18-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和rTaq酶均購自TaKaRa公司(大連); PCR SuperMix、逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript III和PCR Cleanup Kit購自Invitrogen公司(Carlsbad, USA); DNA Marker購自Axygen公司(California, USA); RNA提取試劑CTAB、EDTA、LiCl、β-巰基乙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。引物合成和基因測(cè)序由上海華津生物有限公司完成。

1.2總RNA提取及cDNA的合成

參照岳川等[36]所述方法提取不同處理樣品的總RNA, 然后分別參照SuperScript III試劑盒和Prime Script RT Reagent試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成基因擴(kuò)增用cDNA和表達(dá)分析用cDNA。

1.3CsINV10基因克隆

基于課題組前期對(duì)冷馴化茶樹的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[34], 從中篩選出6條與其他物種中A/N-Inv基因同源的EST序列, 在Seqman軟件中對(duì)這些序列進(jìn)行拼接, 將拼接好的序列在NCBI中進(jìn)行BlastX同源比對(duì)分析, 最后根據(jù)拼接好的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證(引物如表1所示)。PCR反應(yīng)含PCR SuperMix 45 μL、cDNA 1.0 μL、上下游引物各1.0 μL, 加ddH2O至終體積50 μL; 反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 2.5 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃10 min; 4℃保存。PCR反應(yīng)后, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳, 將獲得的條帶利用PCR Cleanup Kit回收純化, 取2 μL回收產(chǎn)物與pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 菌液PCR后挑選陽性單克隆測(cè)序。

1.4生物信息學(xué)分析

利用DNASTAR軟件包中的Seqman軟件對(duì)CsINV10全長(zhǎng)序列進(jìn)行拼接, Editseq進(jìn)行ORF查詢; 在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別用BlastN和BlastX對(duì)核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析; 在ClustalX 2.0軟件中對(duì)多序列比對(duì)后, 利用DNAMAN和MEGA 5.0輸出同源比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果[37]。用ProtParam預(yù)測(cè)蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組分等[38]; SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)[39], TMHMM Server v. 2.0預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu), ProtScale Sever在線分析分析蛋白疏水性, GOR4在線分析CsINV10蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu), TargetP1.1預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位[40], SMART服務(wù)器分析CsINV10蛋白的結(jié)構(gòu)功能, NetPhos 2.0 Server[41]和YinOYang 1.2 Server[42]預(yù)測(cè)蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn), SWISS-MODEL預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu), 通過Phymol軟件編輯得到蛋白三維結(jié)構(gòu)模型[43]。

表1　RT-PCR和qRT-PCR引物對(duì)Table 1　RT-PCR and qRT-PCR primers

1.5CsINV10不同組織中的表達(dá)分析

以實(shí)驗(yàn)室保存的龍井43茶樹不同組織(根、莖、葉、花)為材料進(jìn)行qRT-PCR分析, 參照岳川等[36]所述方法取樣, 以生長(zhǎng)于露天茶園的大小和長(zhǎng)勢(shì)基本一致的2年生盆栽龍井43品種茶樹為材料, 在開花季(10月)分別取茶樹頂端成熟葉、莖干、根系和花在液氮中速凍后–80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ圆铇銹TB為內(nèi)參基因[44], 熒光定量反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上下游引物(10 μmol L–1)(表1)各1 μL、ROX Dye II 0.6 μL、cDNA 2 μL, 加水至終體積20 μL。充分混勻, 短暫離心后, 于ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)?5℃15 s; 94℃ 5 s, 60℃ 34 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后增加熔解曲線。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)學(xué)重復(fù), 最后采用2–ΔΔCT法[45]分析結(jié)果, 并用SPSS18.0軟件分析差異顯著性。

1.6CsINV10不同非生物脅迫下的表達(dá)分析

對(duì)不同脅迫處理(低溫、鹽分、干旱、ABA)茶樹成熟葉片進(jìn)行CsINV10的qRT-PCR分析。參照曹紅利等[46]所述, 選取6盆大小和長(zhǎng)勢(shì)基本一致的盆栽茶樹于LED冷光源植物氣候箱中(24℃, 16 h光照/8 h黑暗, 濕度65%)培養(yǎng)兩周后進(jìn)行4℃低溫處理,分別在處理后0 h、1 h、3 h、9 h、1 d、2 d、3 d和4 d取茶樹頂端第3片成熟葉進(jìn)行基因表達(dá)分析。在溫室中分別隨機(jī)選取3盆大小和長(zhǎng)勢(shì)基本一致的茶樹, 用250 mmol L–1NaCl溶液以澆灌的方式進(jìn)行鹽分處理; 同樣, 另取3盆茶樹用100 mmol L–1的ABA溶液均勻噴灑在茶樹新稍上, 在處理后0 h、1 h、3 h、9 h、1 d、3 d和5 d分別取茶樹頂端第3片成熟葉進(jìn)行基因表達(dá)分析。參照岳川等[36]所述方法, 將3盆大小和長(zhǎng)勢(shì)基本一致的茶樹從盆中取出, 用自來水清洗根系并在純凈水中平衡15 min后, 將茶樹放入10% (w/v) PEG-6000溶液中進(jìn)行干旱脅迫處理, 處理時(shí)間和取樣方法同ABA處理。以茶樹PTB為內(nèi)參基因, qRT-PCR程序及結(jié)果分析參照1.5方法。

2　結(jié)果與分析

2.1CsINV10的克隆

基于課題組前期對(duì)茶樹冷馴化進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果, 從中挑選出與A/N-Inv基因高度同源的6條EST序列, 利用Seqman對(duì)這些序列進(jìn)行拼接獲得一條全長(zhǎng)為2101 bp的核酸序列, 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF Find查找該序列的ORF, 然后進(jìn)行BlastX比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列包含完整的開放閱讀框, 全長(zhǎng)為1923 bp, 編碼640個(gè)氨基酸。根據(jù)序列拼接和比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)1對(duì)RT-PCR引物進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳獲得2.5 kb左右的單一條帶(圖1),將其回收后和pMD18-T連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 挑陽性單克隆搖菌送測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果和之前的拼接結(jié)果基本一致(圖2), 提交GenBank, 登錄號(hào)為KT359348。

圖1　茶樹中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因CsINV10 RT-PCR電泳結(jié)果Fig. 1　Electrophoresis result of neutral/alkaline invertase gene CsINV10 in tea plant

2.2序列結(jié)構(gòu)和同源性分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)CsINV10的氨基酸序列進(jìn)行Blastx比對(duì), 顯示其與荔枝中已報(bào)道的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶LcNI (JQ773414)氨基酸序列相似性最高, 達(dá)80%, 與橡膠樹HbNIN3 (AGU19630)、木薯MeNINV8 (AFH77954)相似性分別為78%和76%。用相鄰連接法構(gòu)建進(jìn)化樹顯示CsINV10與木薯中性/堿性轉(zhuǎn)化酶家族中的MeNINV8 (AFH77954)親緣關(guān)系最近, 與定位于葉綠體上的擬南芥At-A/N-InvE (At5g22510)、水稻OsNIN3 (AK121301)聚為一類(圖3)。因而, 推測(cè)CsINV10蛋白可能也定位于葉綠體, 屬于A/N-Inv α亞家族成員。

結(jié)合聚合進(jìn)化樹分析結(jié)果, 從中挑選部分At-A/ N-Inv蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(圖4)。所有比對(duì)序列中間大約450 bp左右的氨基酸序列具有較高的保守性。另外, 在這些保守氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)有38個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基能用于將At-A/N-Inv分成不

同的亞家族, 其中30個(gè)氨基酸位點(diǎn)能將At-A/N-Inv分成α和β亞家族(紅色框內(nèi)所示), 4個(gè)位點(diǎn)能將定位于線粒體的At-A/N-Inv與葉綠體、細(xì)胞質(zhì)中的At-A/N-Inv區(qū)分開(橙黃色框內(nèi)所示), 3個(gè)位點(diǎn)能將定位于葉綠體上的At-A/N-Inv與定位于線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的At-A/N-Inv分開(黃色框內(nèi)所示), 還有1個(gè)氨基酸位點(diǎn)能分別將定位于葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)的At-A/N-Inv區(qū)分開(綠色框內(nèi)所示)。利用這些特異的氨基酸位點(diǎn)可將不同的At-A/N-Inv定位于不同的亞細(xì)胞中, 這種分類結(jié)果和利用系統(tǒng)進(jìn)化樹的分類結(jié)果完全一致。

圖2　CsIINV10的編碼序列Fig. 2　Encoding sequence of CsIINV10下畫線部分代表CsINV10的開放閱讀框, 粗體字分別代表起始子和終止子, 陰影部分代表保守結(jié)構(gòu)域。The underlined part represents open reading frame of CsINV10, the shadow represents conserved domains and the bolds represent start codon and terminator respectively.

2.3蛋白序列基本性質(zhì)分析

2.3.1理化性質(zhì)分析利用ProtParam預(yù)測(cè)CsINV10蛋白分子量為71.8 kD, 理論等電點(diǎn)pI為5.69, 總共包括10034個(gè)原子, 分子式為C3223H4981N857O944S29。在組成CsINV10蛋白的20種氨基酸中,亮氨酸(Leu)所占比例最高, 達(dá)到9.7%, 而組氨酸(His)所占的比例最低, 為1.7%; CsINV10蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.81, 脂肪指數(shù)為87.61, 總平均親水性(GRAVY)為–0.166, 根據(jù)Guruprasad法判斷該蛋白不穩(wěn)定。

2.3.2信號(hào)肽分析SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)該蛋白信號(hào)肽顯示S平均值(mean S-score)為0.237<0.5,因而預(yù)測(cè)為不包含信號(hào)肽, 屬于非分泌蛋白和非N端糖基化蛋白。

2.3.3疏水性分析利用ProtScale Sever 在線分析軟件中的Hyhob/Kyte & Doolittle 法對(duì)該基因的親水性和疏水性預(yù)測(cè)顯示(圖5), 最大正值為2.467,最小負(fù)值為–3.267, 表明該蛋白屬于親水性蛋白。2.3.4跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用在線軟件TMHMM Server v. 2.0對(duì)CsINV10進(jìn)行跨膜區(qū)分析顯示, 該蛋白不存在跨膜螺旋區(qū), 不屬于跨膜蛋白(圖6), 這和該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果(圖5)基本一致。

2.3.5亞細(xì)胞定位TargetP1.1在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位顯示目的蛋白最可能定位于葉綠體上, 這與系統(tǒng)進(jìn)化樹預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)一致。

2.3.6卷曲螺旋(Coil區(qū))分析GOR4在線軟件分析CsINV10蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)顯示, CsINV10

蛋白由26.88% α-螺旋、21.56% β-折疊和51.56%無規(guī)則卷曲組成。

2.3.7蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)利用NetPhos 2.0 Server對(duì)CsINV10蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示, 該蛋白在翻譯后可能存在28個(gè)磷酸位點(diǎn),其中包含14個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、4個(gè)蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)和9個(gè)絡(luò)氨酸(Tyr)位點(diǎn)(圖7)。利用YinOYang 1.2 Server進(jìn)行蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè), 結(jié)果顯示該蛋白氨基酸序列中包含11個(gè)潛在的O-GlcNAc位點(diǎn), 包括Ser (2、3、4、24、83、183、295、466、519、634)殘基和一個(gè)Thr (182)殘基, 其中絲氨酸(519)可能是YinYang位點(diǎn)(圖8)。

2.4結(jié)構(gòu)域及motif搜索

用SMART對(duì)CsINV10蛋白的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)顯示, CsINV10蛋白氨基酸序列156～599位之間高度保守(圖2), 屬于糖苷水解酶家族100 (G100)成員共有的典型結(jié)構(gòu)域, 可能具有糖肽α-N-乙酰半乳糖胺酶活性。

2.5CsINV10三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SWISS-MODEL在線軟件對(duì)CsINV10三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后, 利用PhyMol軟件編輯獲得圖9所示結(jié)果, CsINV10 (194-552)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由14個(gè)α螺旋、17個(gè)無規(guī)則卷曲和第2和第3個(gè)α螺旋之間的2個(gè)小的β折疊構(gòu)成。

圖3　CsINV10與其他物種中的A/N-Inv氨基酸序列聚合進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig. 3　Phylogenetic tree of amino acid of CsINV10 and A/N-Inv in other plants參與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的A/N-Inv分別為: 擬南芥A/N-InvA～I(xiàn) (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510)、水稻OsNIN1～3, 7～8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741)、木薯MeNINV1～10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533729, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533731, KF533732)、小麥Ta-A/N-INV AM295169)、甜菜BvINV (AJ422050)、胡蘿卜DcINV (Y16262)、百脈根LjInv1 (AJ717412)、毒麥LtINV (AJ003114)、甘蔗SoNIN1 (JX109944)、橡膠樹HbNIN1 (GU573728)和HbNIN2 (GU573727)、茶樹CsINV10 (KT359348)。The Phylogenetic tree grouped by A/N-InvA–I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510), Arabidopsis thaliana; OsNIN1–3, 7–8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741), Oryza sativa; MeNINV1–10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533729, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533731, KF533732), Manihotesculentacrantz; Ta-A/N-INV (AM295169), Triticum aestivum; BvINV (AJ422050), Beta vulgaris; DcINV (Y16262), Daucuscarota; LjInv1 (AJ717412), Lotus japonicus; LtINV (AJ003114), Lolium temulentum; SoNIN1 (JX109944), Saccharum officinarum; HbNIN1 and HbNIN2 (GU573728, GU573727), Hevea brasiliensis; CsINV10 (KT359348), Camellia sinensis.

圖4　CsINV10與其他物種中的A/N-Inv氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)果Fig. 4　Homologous analysis of amino acid sequences among different plants參與同源比對(duì)的A/N-Inv分別為茶樹CsINV10 (KT359348)、擬南芥A/N-InvA～I(xiàn) (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510)、水稻OsNIN1～3, 7～8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741)、木薯MeNINV1～4, 6～8, 10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533732)。紅色框用于區(qū)分α和β亞族, 黃色框用于區(qū)分葉綠體定位的A/N-Inv, 橙色框用于區(qū)分線粒體定位的A/N-Inv, 綠色框用于區(qū)分細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體定位的A/N-Inv; 紅色箭頭代表可能的催化位點(diǎn)。The homologous sequences include A/N-InvA–I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510), Arabidopsis thaliana; OsNIN1–3, 7–8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741), Oryza sativa; MeNINV1–4, 6–8, 10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533732), Manihot esculenta Crantz; CsINV10 (KT359348), Camellia sinensis. The red boxes are used to separate α and β subfamily, orange boxes to separate A/N-Invs located in mitochondria, yellow boxes to separate A/N-Invs located in chloroplast, and green box to identify different A/N-Invs located in cytoplasm, chloroplast and mitochondria. The red arrow represents candidate catalytic residues.

圖5　CsINV10親水性/疏水性分析Fig. 5　Hydrophobicity/hydrophilicity analysis of CsINV10

圖6　CsINV10蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 6　Prediction model for transmenbrane domain of CsARF1 protein

圖7　CsINV10磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig. 7　Phosphorylation sites prediction of CsINV10 protein

圖8　CsINV10糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig. 8　Glycosylation sites prediction of CsINV10 protein

2.6CsINV10基因的表達(dá)模式分析

2.6.1組織表達(dá)差異性圖10表明, CsINV10基因在成熟葉片和花中的表達(dá)要明顯高于根系中的表達(dá), 莖干中的表達(dá)量較成熟葉片和花都要低, 但也比根系中高, 說明該基因在茶樹中具有組織表達(dá)特異性。

2.6.2不同非生物脅迫下的表達(dá)模式NaCl處理下, 茶樹成熟葉片中CsINV10基因表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)(圖11), 在處理5 d后,其表達(dá)量為未處理前的13倍, 差異達(dá)到顯著水平。PEG條件下, 葉片中該基因的表達(dá)量在處理后3 h達(dá)到最大值, 是處理前的5.3倍, 隨后又逐漸降低并在處理后1 d達(dá)到最小值, 而后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), 表達(dá)又逐漸升高, 在處理5 d后其表達(dá)量又基本恢復(fù)到處理3 h的水平。ABA處理下, 該基因表達(dá)量在處理后3 h達(dá)到最大值, 隨后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)。低溫條件下, CsINV10基因在茶樹成熟葉中的表達(dá)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)

先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì), 在處理3 h后表達(dá)量達(dá)最小值, 隨后逐漸升高, 在處理4 d后為處理前的5.7倍。表明CsINV10基因的表達(dá)受多種逆境脅迫誘導(dǎo), 同時(shí)ABA能夠瞬時(shí)誘導(dǎo)該基因的表達(dá), 而低溫、PEG和鹽分處理下該基因表達(dá)量在處理1 d后較對(duì)照都要高, 說明該基因可能作為一個(gè)長(zhǎng)效表達(dá)基因參與響應(yīng)茶樹的逆境脅迫。

圖9　CsINV10蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 9　Three-dimension structure of CsINV10 protein

圖10　同一品種不同組織器官中CsINV10的表達(dá)分析Fig. 10　Expression analysis of CsINV10 in different organs of a tea plant柱上小寫字母不同表示差異達(dá)到顯著水平(P < 0.05)。The columns with different small letters are significantly different (P < 0.05).

3　討論

圖11　CsINV10在不同非生物脅迫下的表達(dá)分析Fig. 11　Expression analysis of CsINV10 in various abiotic stresses柱上小寫字母不同表示差異達(dá)到顯著水平(P < 0.05)。The columns with different small letters are significantly different (P < 0.05).

在氨基酸序列中, CWIN和VIN在接近成熟蛋白N端處都有一個(gè)β-呋喃果聚糖苷酶基序(NDPD/ NG)[1], 而在接近C端則有一段保守的(WECV/PD),該序列被認(rèn)為是酸性轉(zhuǎn)化酶蛋白家族中保守結(jié)構(gòu)域和催化活性所必須的序列[47], 而A/N-Inv缺乏N端信號(hào)肽, 既不是糖基化蛋白, 也不是β-呋喃果糖苷酶, 具體催化位點(diǎn)依然未知。酸性轉(zhuǎn)化酶能夠水解包含有β-呋喃果糖苷基的低聚糖糖如蔗糖、棉子糖和水蘇糖等, 而A/N-Inv只能特異水解蔗糖。本研究從茶樹成熟葉片中克隆的轉(zhuǎn)化酶基因, 通過與其他物種中已報(bào)道的A/N-Inv進(jìn)行氨基酸比對(duì)顯示, 這類轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列中間的450多個(gè)氨基酸具有較高的保守性, 而N端和C端的同源性非常低, 在這段保守結(jié)構(gòu)域中存在多個(gè)能將不同亞細(xì)胞定位的A/N-Inv區(qū)分開的氨基酸殘基位點(diǎn), 同時(shí)還包含Ji 等[19]報(bào)道的12個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)潛在的催化殘基Asp88和Asp149 (圖4紅色箭頭所示)。此外, CsINV10的氨基酸序列與茶樹中已報(bào)道的酸性轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列基本沒有同源性, 而與另外幾個(gè)預(yù)測(cè)為A/N-Inv基因的序列具有較高同源性, CsINV10氨基酸序列不包含酸性轉(zhuǎn)化酶的特征五肽(NDPNG)和(WECV/PD), N端不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽, 且具有較高的親水性。CsINV10蛋白氨基酸序列性質(zhì)和胡蘿卜[4]、小麥[10]、甘蔗[24]等的A/N-Inv蛋白性質(zhì)

相似, 說明我們所克隆獲得的CsINV10也屬于A/N-Inv基因。根據(jù)進(jìn)化樹分析顯示, CsINV10與水稻OsNIN3和擬南芥A/N-InvE聚為一大類, 而OsNIN3和A/N-InvE均已報(bào)道定位于葉綠體, 因而推測(cè)CsINV10也可能定位于葉綠體, 這與TargetP1.1預(yù)測(cè)結(jié)果一致。然而, 本研究所報(bào)道的CsINV10在酶學(xué)水平上, 具體屬于中性還是堿性轉(zhuǎn)化酶, 最佳pH值為多少; 它的底物特異性如何, 米氏常數(shù)(Km)值為多少, 催化位點(diǎn)在哪等眾多問題還需要我們后期更深入的研究后才能確定。

目前, 很多研究認(rèn)為A/N-Inv在調(diào)控植物根系生長(zhǎng)和生殖發(fā)育方面具有重要作用。Qi等[28]對(duì)擬南芥Atcyt-inv1突變體研究發(fā)現(xiàn), Atcyt-inv1能夠通過控制細(xì)胞內(nèi)己糖濃度來抑制側(cè)根發(fā)育, 擬南芥中另外2個(gè)A/N-Inv基因AtCIN7和AtCIN9 (cINV1/cINV2)雙突變的突變體中A/N-Inv活性較對(duì)照降低了40%,抑制了根系生長(zhǎng), 同時(shí)還伴隨著細(xì)胞的畸形擴(kuò)增[48]。相似地, 百脈根中的LjCIN1 (LjINV1)突變后降低了根系和莖干的生長(zhǎng)、阻遏花粉形成和損害開花[23],水稻中OsCIN8 (OsCyt-INV1)的突變?cè)斐赏蛔凅w植株根系變短, 推遲開花和部分不育[32]。植物中組織器官的生長(zhǎng)不僅需要己糖作為能量和碳的來源, 還需要一個(gè)細(xì)胞伸長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)力, 即相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞滲透壓和一個(gè)細(xì)胞壁伸展性的增加[1]。在上述突變體中根系縮短可能是由于轉(zhuǎn)化酶活性的降低導(dǎo)致己糖含量匱乏使得細(xì)胞壁元件合成減少和細(xì)胞延長(zhǎng)所需的驅(qū)動(dòng)力降低, 最終降低細(xì)胞長(zhǎng)度。碳水化合物在花藥和花粉發(fā)育中具有重要作用, 對(duì)馬鈴薯[49]和煙草[50]花藥組織中的胞外轉(zhuǎn)化酶研究發(fā)現(xiàn)蔗糖的胞外水解和花藥、花粉之間存在緊密的聯(lián)系, A/N-Inv活性的變化會(huì)影響花粉的育性。本研究通過對(duì)茶樹不同組織中CsINV10的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在茶樹成熟葉和花中其表達(dá)量最高, 莖干中的表達(dá)量則低于二者, 這可能與CsINV10蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠體有關(guān)。茶樹作為常綠植物, 葉片中較高的A/N-Inv活性能夠充分水解光合產(chǎn)物——蔗糖產(chǎn)生大量葡萄糖和果糖參與到茶樹生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過程, 而葉片中的葉綠體作為植物參與光合作用的主要細(xì)胞器, 其內(nèi)部可能存在較高的A/N-Inv活性以參與蔗糖水解過程。莖干作為蔗糖運(yùn)輸通道, 較低的A/N-Inv活性可能更利于蔗糖通過產(chǎn)生濃度梯度從源器官向庫器官中運(yùn)輸。而花作為快速生長(zhǎng)分化組織, 較高的A/N-Inv活性能夠促進(jìn)蔗糖的水解合成己糖, 為開花過程提供必要的碳水化合物來源?；贑sINV10基因在茶樹成熟葉和花中較高的表達(dá)量, 推測(cè)該基因可能主要在參與響應(yīng)茶樹體內(nèi)蔗糖從“源器官”到“庫器官”的分配、生長(zhǎng)發(fā)育、開花結(jié)果等方面具有重要作用, 但關(guān)于A/N-Inv基因是如何介導(dǎo)響應(yīng)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程, 比如是通過糖信號(hào)途徑還是通過不同信號(hào)途徑(如赤霉素、細(xì)胞分裂素和磷脂酰肌醇等)之間互作等眾多問題都還有待更深入的研究。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)CsINV10基因在茶樹根系中的表達(dá)量較其他組織都低, 推測(cè)該基因在響應(yīng)茶樹根系生長(zhǎng)方面的作用可能并不明顯, 原因可能也和CsINV10的亞細(xì)胞定位有關(guān), 該蛋白的亞細(xì)胞定位與上述報(bào)道的AtCIN7、AtCIN9、LjCIN1、OsCIN8不同, 后四者都被報(bào)道定位于細(xì)胞質(zhì)中, 屬于β亞家族, 同時(shí)四者相互之間具有較高的同源性。因此, 我們推測(cè)在茶樹中可能還存在能特異調(diào)控茶樹根系生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)化酶基因, 但這還需我們后續(xù)深入研究。

最近有研究表明植物體內(nèi)的A/N-Inv基因被敲除后, 突變體植株中由于A/N-Inv活性的降低或缺失對(duì)植株造成了葉片、莖干、根系生長(zhǎng)不良和花期推遲等不良影響, 說明A/N-Inv是植物生長(zhǎng)和發(fā)育不可或缺的部分[29]。此外, 植物A/N-Inv在脅迫條件下還伴隨著酶活性的升高[32,48], 其可能通過調(diào)控細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器中蔗糖濃度, 或是通過調(diào)控能被線粒體中相關(guān)己糖激酶響應(yīng)或作為己糖激酶底物的葡萄糖濃度來調(diào)節(jié)線粒體活性氧的平衡。Xiang等[29]分別敲除擬南芥中定位于細(xì)胞質(zhì)的At-A/N-InvG和線粒體中的At-A/N-InvA基因后發(fā)現(xiàn), 缺失突變體的生長(zhǎng)明顯受到抑制, 兩種突變體中的A/N-Inv活性都降低了30%以上; 另外, 他們對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行過氧化氫處理后發(fā)現(xiàn), At-A/N-Inv基因和HXK1在野生型中的表達(dá)量都明顯增加, 因而推測(cè)At-A/N-Inv可能作為抗氧化系統(tǒng)的成員參與調(diào)控胞內(nèi)活性氧的平衡。Vargas 等[10]對(duì)小麥一個(gè)堿性轉(zhuǎn)化酶在不同環(huán)境脅迫中活性變化情況的研究表明, 在低溫和甘露醇處理小麥72 h中, 小麥體內(nèi)A/N-Inv活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì), 在處理24 h后達(dá)到最高, 隨后緩慢降到一定程度后便維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定水平, 同時(shí), 一個(gè)堿性轉(zhuǎn)化酶基因Ta-A-Inv在低溫和甘露醇處理72 h后表達(dá)量較對(duì)照要高, 推測(cè)小麥幼苗葉片中A/N-Inv水解蔗糖可能作為植物常規(guī)代謝機(jī)制的開端, 通過提供較高的能量和生物合成化合物來抵

御逆境脅迫。本研究發(fā)現(xiàn), 在4℃低溫條件下, 茶樹成熟葉片中CsINV10基因的表達(dá)呈先降后升趨勢(shì), ABA和PEG處理下則呈現(xiàn)瞬時(shí)增加后急劇降低趨勢(shì),但與ABA不同的是, PEG處理下該基因的表達(dá)量在降到一定程度后又隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。而在NaCl處理?xiàng)l件下, 該基因隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上調(diào)表達(dá), 在處理5 d后, 表達(dá)量較處理前提高了13倍, 呈極顯著水平。總體而言, 無論是低溫、鹽分還是PEG脅迫處理茶樹1 d后, CsINV10的表達(dá)量都較對(duì)照要高, 并隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高, 說明該基因能夠響應(yīng)茶樹非生物逆境脅迫, 其在參與茶樹抵御環(huán)境脅迫方面可能具有重要作用。然而, 王菲[51]報(bào)道的一個(gè)枳葉片中的中性轉(zhuǎn)化酶基因PtrNINV在低溫、干旱、鹽脅迫下的表達(dá)模式卻與CsINV10基因在相同逆境脅迫下的表達(dá)相反, 這些A/N-Inv基因在不同物種中表達(dá)模式的差異可能受物種間差異限制, 同時(shí)也可能與它們的亞細(xì)胞定位或最佳酶活pH不同有關(guān)。PtrNINV被報(bào)道定位于細(xì)胞質(zhì)中的線粒體上, 屬于中性轉(zhuǎn)化酶基因[51], 而我們所克隆的CsINV10根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示定位于葉綠體上。由于時(shí)間和空間的差異使得不同亞細(xì)胞定位的A/N-Inv基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)可能有不同的時(shí)空表達(dá)模式。

本研究明確了該類酶編碼基因在茶樹響應(yīng)逆境脅迫中的表達(dá)模式, 但關(guān)于它們?cè)诓铇淇鼓嬷械淖饔脵C(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。例如: (i)茶樹逆境脅迫下A/N-Inv活性變化與A/N-Inv基因表達(dá)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系如何; (ii)脅迫條件下, A/N-Inv與激素之間是否具有對(duì)應(yīng)關(guān)系, 又是通過什么信號(hào)途徑參與調(diào)控茶樹體內(nèi)活性氧的平衡; (iii)不同細(xì)胞器中A/N-Inv和AI基因之間在茶樹逆境下是如何協(xié)同表達(dá); (iv)逆境下, A/N-Inv基因表達(dá)的高低是否由相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控。同時(shí), A/N-Inv活性變化除被相應(yīng)A/N-Inv基因調(diào)控外, 其他影響因素又是什么等問題,有待在以后的研究中逐一揭開。

4　結(jié)論

克隆獲得一個(gè)全長(zhǎng)ORF為1923 bp, 編碼640個(gè)氨基酸的A/N-Inv基因CsINV10, 該基因編碼的蛋白氨基酸序列無N-端信號(hào)肽, 無跨膜結(jié)構(gòu)域, 屬于親水性蛋白并定位于葉綠體。茶樹中CsINV10的表達(dá)具有組織表達(dá)差異性, 該基因的表達(dá)受多種逆境脅迫誘導(dǎo), 表明它與茶樹抗逆響應(yīng)密切相關(guān)。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.008.html

Cloning and Expression Analysis of a Neutral/alkaline Invertase Gene (CsINV10) in Tea Plant (Camellia sinensis L. O. Kuntze)

QIAN Wen-Jun1,2, YUE Chuan2, CAO Hong-Li2, HAO Xin-Yuan2, WANG Lu2, WANG Yu-Chun1,2, HUANG Yu-Ting2, WANG Bo2, WANG Xin-Chao2, XIAO Bin1,*, and YANG Ya-Jun1,2,*1College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2Tea Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Abstract:Based on the comprehensive RNA-Seq analysis of tea plant during cold acclimation stage, we picked out six ESTs sequences with a high similarity to neutral/alkaline invertase gene to get a splicing. As a result, a full-length of 2101 bp nucleotide sequence was obtained from tea plant after validated by using RT-PCR technique. Bioinformatics analysis showed that the sequence containing 1923 bp ORF (Open Reading Fram) and encoding 640 amino acid residues with a putative molecular mass of 71.8 kD and theoretical isoelectric point of 5.69, was named as CsINV10 (GenBank accession number: KT359348). BlastX and phylogenetic analysis indicated that the protein encoded by CsINV10 shared the highest identity (80%) with LcNI in Litchi, and had a closest genetic relationship with MeNINV8 in Manihot esculenta Crantz. Also, CsINV10 as a neutral/alkaline invertase gene could be classified into G100 family. The protein had no N-terminal signal peptide and transmembrane domain, and was predi-

cated to be a hydrophilic protein localized in chloroplast. The expression analysis of CsINV10 under different abiotic stress conditions showed that cold, PEG and salt stresses could gradually promote the expression of CsINV10 when treated for one day, however, it had a transient increase when treated by ABA for three hours. Consequently, we speculated that CsINV10 might be involved in the tea plant response to abiotic stresses. Moreover, we found that CsINV10 had a tissue-specific expression pattern in leaf and flower. These results provide a theoretical basis for the functional analysis of invertase genes of tea plant in response to various stresses.

Keywords:Tea plant (Camellia sinensis); Neutral/alkaline invertase gene; Expression analysis

收稿日期Received(): 2015-08-12; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-18.

通訊作者*(Corresponding authors): 楊亞軍, E-mail: yjyang@mail.tricaas.com, Tel: 0571-86653162; 肖斌, E-mail: xiaobin2093@sohu.com

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00376