楊江濤　龐偉民　王旭靜　呂少溥　唐巧玲　王志興中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

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陸地棉GhRACK1啟動子的克隆與缺失分析

楊江濤龐偉民王旭靜*呂少溥唐巧玲王志興*
中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

摘要:在基因工程發(fā)展中, 有應用前景的纖維特異表達啟動子的缺乏是制約棉花纖維品質(zhì)改良的主要因素之一。本研究利用反向PCR方法克隆到陸地棉纖維優(yōu)勢表達基因GhRACK1的上游啟動子GhRACK1-P。GhRACK1-P全長為1987 bp, 含有TATA-box、CAAT-box、MYB2和I-box等順式作用元件和調(diào)控元件。根據(jù)調(diào)控元件的分布對GhRACK1-P進行不同程度的缺失, 獲得了p1、p2、p3和p4缺失體; 構建不同缺失體和全長GhRACK1-P的植物表達載體, 并通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草, 獲得不同類型轉基因煙草。GUS組織化學染色結果表明, 全長啟動子GhRACK1-P只能驅動gus基因在轉基因煙草的幼根及根毛中表達, 其他缺失體驅動gus基因在轉基因煙草的花粉、葉片和根中表達, 為組成型表達啟動子。由于根毛與棉花纖維具有相似的發(fā)育機制, 推測全長GhRACK1-P可能為纖維優(yōu)勢表達啟動子。本研究結果為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供了新的調(diào)控元件。

關鍵詞:纖維優(yōu)勢表達; GhRACK1啟動子; 克隆; 缺失分析

本研究由國家轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08010-005)資助。

This study was supported by the National Major Project of Breeding for New Transgenic Organisms (2014ZX08010-005).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: JT_Y1990@163.com

我國既是棉花生產(chǎn)大國, 也是原棉消費大國,棉花生產(chǎn)在國民經(jīng)濟中占有十分重要的地位。目前我國棉花纖維品質(zhì)中等且單一, 雖然基本上可滿足紡織業(yè)的要求, 但原棉品質(zhì)不如美國和澳大利亞等產(chǎn)棉國, 缺乏國際競爭力。因此, 棉花纖維品質(zhì)改良成為當前我國棉花育種的主要目標之一。

受種質(zhì)資源缺乏、育種周期長、產(chǎn)量性狀與品質(zhì)性狀負相關等因素的影響, 利用常規(guī)育種技術較難培育出纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花新種質(zhì)。基因工程技術的發(fā)展為培育纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花新品種提供了

新的途徑。經(jīng)過近20年的努力, 目前研究者們已克隆了多個纖維發(fā)育相關基因和纖維優(yōu)勢表達啟動子,并在棉花纖維品質(zhì)改良基因工程中得到應用, 取得了可喜的進展[1-5], 但目前仍缺乏有真正應用價值的優(yōu)良基因和調(diào)控元件。

RACK1蛋白(receptor for activated C kinase 1,活化態(tài)C激酶1受體)普遍存在于動植物中, 是一種高度保守的WD40重復蛋白, 在細胞骨架、蛋白運輸、細胞信號轉導及分生組織形成等生命活動中扮演重要角色[6]。自1993年首次從煙草愈傷組織中克隆了對生長素2,4-D響應的RACK1基因以來[7], 目前已從擬南芥、水稻、煙草、苜蓿、油菜等多種植物中克隆到了RACK1基因[7-11]。本實驗室通過葉片和纖維差減雜交得到了RACK1基因的EST序列, 并通過RACE技術克隆得到了GhRACK1基因的全長序列, RT-PCR表明此基因在纖維中優(yōu)勢表達, 熒光定量PCR分析表明此基因在纖維伸長期的表達量大約是葉片中的20倍左右, 上述結果均表明GhRACK1在纖維中優(yōu)勢表達[12]。

鑒于GhRACK1在纖維中優(yōu)勢表達, 本研究通過反向PCR方法克隆GhRACK1基因的5′上游啟動子GhRACK1-P, 根據(jù)GhRACK1-P上調(diào)控元件的分布進行不同程度的缺失, 利用GhRACK1-P缺失體驅動gus基因在煙草中表達, 分析不同GhRACK1-P缺失體轉基因煙草中GUS的組織表達模式, 以期獲得棉纖維中優(yōu)勢表達的啟動子, 為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供新的調(diào)控元件。

表1　反向PCR擴增所需引物和模板Table 1　Primer and template for inverse-PCR amplification

1　材料與方法

1.1試驗材料

煙草品種NC89、陸地棉蘇棉12、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達載體pCamBIA 2300由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶、Taq酶和T4連接酶購自TaKaRa或NEB試劑公司。其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2反向PCR克隆GhRACK1基因的啟動子GhRACK1-P

利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化,北京)提取蘇棉12的基因組DNA。分別經(jīng)Bgl II和Msc I單酶切后自連環(huán)化。同時根據(jù)已知序列設計引物并進行反向PCR擴增, 反應所需引物和模板詳見表1。PCR條件94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 72～63℃ 30 s, 72℃, 3 min, 每循環(huán)降低1℃, 依次進行10個循環(huán); 94℃ 30 s, 66℃ 30 s, 72℃ 3 min, 30個循環(huán); 72℃10 min。最終PCR產(chǎn)物與T-載體連接后轉化大腸桿菌, 挑選陽性克隆并測序鑒定。

1.3GhRACK1-P缺失體的克隆與植物表達載體構建

根據(jù)GhRACK1-P序列設計引物R-1、F-600、F-1036、F-1260、F-1620和F-1987。為構建載體方便, 在R-1的3′端添加了Xba I酶切位點, 在F-1987、F-600、F-1036、F-1260和F-1620的3′端添加了Pst I酶切位點。以GhRACK1-P質(zhì)粒為模板, 以R-1/F-1987、R-1/F-600、R-1/F-1036、R-1/F-1260和R-1/F-1620為引物進行PCR擴增, 反應條件為94℃

5 min; 94℃ 45 s, 62℃或55℃ 30 s, 72℃ 1～2 min, 30個循環(huán); 72℃ 10 min (表2)。獲得的PCR產(chǎn)物與T-載體連接后轉化大腸桿菌, 挑選陽性克隆并測序鑒定, 正確的陽性克隆分別被命名為GhRACK1-P、p1、p2、p3和p4。

Hind III和EcoR I雙酶切pBI121和pCamBIA 2300, 分別回收3 kb和9 kb左右的DNA條帶, 連接后形成中間載體pCamBIA230035S。Pst I和Xba I雙酶切pCamBIA230035S、p1、p2、p3、p4和GhRACK1-P, 分別回收大片段和相應的小片段, 連接后形成植物表達載體PGhrack-1、PGhrack-2、PGhrack-3、PGhrack-4和PGhrack-5。

1.4農(nóng)桿菌介導法轉化煙草

利用熱擊法將表達載體PGhrack-1、PGhrack-2、PGhrack-3、PGhrack-4和PGhrack-5轉入農(nóng)桿菌LBA4404。含有目標載體的農(nóng)桿菌LBA4404在含有250 mg L–1鏈霉素、250 mg L–1利福平和100 mg L–1卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中被活化。收集菌體并用液體MS基本培養(yǎng)基重懸稀釋至OD600為0.1～0.2。將繼代培養(yǎng)15 d左右的煙草組培苗葉片切成2 mm左右的長條, 于農(nóng)桿菌液中侵染10 min。然后放在含有2 mg L–16-BA和0.5 mg L–1NAA的MS培養(yǎng)基上, 25℃暗培養(yǎng)3～4 d。將外植體轉移到含有NAA 0.5 mg L–1、6-BA 2 mg L–1、Kan 100 mg L–1和Carb 500 mg L–1的MS固體培養(yǎng)基上分化培養(yǎng), 3～4周后即有再生芽的出現(xiàn)。待再生芽長到1 cm左右時, 將其移到含有Kan 100 mgL–1和Carb 500 mg L–1的MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。

1.5轉基因煙草的PCR檢測

根據(jù)GhRACK1-P缺失體序列設計系列引物。提取轉基因煙草基因組DNA, 利用對應的引物進行PCR擴增, 反應條件為94℃ 5 min; 95℃ 1 min, 50～54℃ 30 s, 72℃ 1 min, 32個循環(huán); 72℃ 10 min,具體見表3。

表2　GhRACK1-P缺失體的克隆所需引物和反應條件Table 2　Primer and PCR progress for cloning of GhRACK1-P truncations

表3　轉基因煙草PCR檢測所需引物Table 3　Primers for PCR detection of transgenic tobacco

1.6GUS組織化學染色

參考Jefferson等[13]的方法, 將植物組織浸入適量X-Gluc溶液中, 密封, 37℃避光過夜, FAA固定15 min, 然后依次用75%、85%、95%和100%酒精脫色,觀察是否有藍色出現(xiàn)。

2　結果與分析

2.1GhRACK1-P的克隆及序列分析

第一次反向PCR獲得了514 bp的上游序列, 第二次反向PCR獲得了1473 bp的上游序列。將兩次反向PCR所得序列拼接后獲得了GhRACK1基因的5′端上游序列1987 bp。

利用http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html在線軟件預測GhRACK1基因上游的1987 bp中可能的轉錄起始位點, 發(fā)現(xiàn)它可能位于–71 bp, 序列為TCATTCT, 此序列符合PyPyANT/APyPy的保守序列結構。PlantCare分析其上面調(diào)控元件的分布,發(fā)現(xiàn)此序列上除了含有TATA-box、CAAT-box等順式作用元件外, 還含有3個與根特異表達有關的RootmotifTAPOX1、1個與表皮毛發(fā)育有關的MYB2、以及TBOX、LIBOX、IBOXCORE等組織特異性調(diào)控元件(圖1)。

圖1　GhRACK1-P的序列及其部分調(diào)控元件Fig. 1　Sequence of GhRACK1-P and its partial regulation elements

2.2啟動子缺失及植物表達載體的構建

根據(jù)GhRACK1-P序列上與表皮毛、根、纖維特異表達相關作用因子的分布, 對GhRACK1-P進行了不同程度的缺失, 利用PCR方法克隆得到了p1、p2、p3、p4 四個缺失體。相對于全長啟動子GhRACK1-P來說, p4缺失體上主要缺失了與表皮毛發(fā)育相關的調(diào)控元件MYB2, p3缺失體上主要缺失了表皮毛發(fā)育相關的調(diào)控元件MYB2、組織特異性啟動元件OSE1、種皮特異性啟動元件PROLAMIBOX, p2缺失體上主要缺失了表皮毛發(fā)育相關的調(diào)控元件MYB2、根特異表達調(diào)控元件RootmotifTAPOX1、組織特異性啟動元件OSE1、種皮特異性啟動元件PROLAMIBOX、纖維特異相關的啟動子元件L1BOX、參與棉花纖維發(fā)育與乙烯合成途徑的IBOXCORE等, p1缺失體上缺失了所有的與根和纖維特異表達相關的調(diào)控元件, 主要含有TATA-box、CAAT-box等啟動子必需的調(diào)控元件(圖2)。

以pCAMBIA2300為基礎載體, 以gus為報告基因, 分別構建了全長啟動子GhRACK1-P和4個啟動子缺失體的植物表達載體。在構建的系列植物表達載體中, 報告基因gus基因由GhRACK1啟動子的不同缺失體驅動, 由nos終止子終止表達; 篩選標記基因為npt II, 由CaMV 35S啟動子驅動表達, 35S polyA終止表達。構建的植物表達載體經(jīng)多酶切鑒定和測序證明是正確的(圖3)。

圖2　GhRACK1-P的缺失示意圖Fig. 2　Schematic diagram of deletion of GhRACK1-P

圖3　植物表達載體基因表達盒示意圖Fig. 3　Schematic diagram of plant expression vector35S P: CaMV 35S promoter; npt II: Neomycin phosphotransferase gene; 35S polyA: CaMV 35S 3’-UTR polyA; PGhrack promoter: different truncation of GhRACK1-P; gus: Beta glucuronidase gene; Nos T: Nos terminor.

2.3不同缺失體轉基因煙草的獲得和PCR檢測

將含不同啟動子缺失體的植物表達載體通過凍融法導入農(nóng)桿菌LBA4404, 并利用農(nóng)桿菌介導法導入煙草NC89中, 獲得了分別含有啟動子缺失體p1、p2、p3、p4和全長啟動子GhRACK1-P的轉基因煙草。

提取轉基因煙草DNA進行PCR檢測, 結果不同類型的轉基因煙草中均擴增出了相應的目的條帶,含有啟動子缺失體p1、p2、p3和p4和全長啟動子GhRACK1-P的轉基因煙草中擴增的目的條帶大小分別約為330、790、486、521、971和450 bp (圖4)。經(jīng)PCR檢測后, 分別獲得了40、28、32、34和41株含有啟動子缺失體p1、p2、p3、p4和全長啟動子GhRACK1-P的轉基因煙草。

2.4不同缺失體的時空表達模式分析

分別取不同類型轉基因煙草的根、葉和花粉經(jīng)GUS組織化學染色發(fā)現(xiàn), 含有啟動子缺失體p1、p2、p3和p4的轉基因煙草的根、葉和花粉中均有GUS的表達, 而全長啟動子GhRACK1-P的轉基因煙草只能在幼根及根毛中檢測到GUS表達。說明只有全長啟動子GhRACK1-P為幼根及根毛特異表達, 其他缺失體均為組成型表達(圖5)。相對于啟動子缺失體而言, 全長啟動子序列主要增加了MYB2元件和ROOTMOTIFTAPOX1等與表皮毛和根特異表達有關的調(diào)控元件, 據(jù)此推測, 全長啟動子上的這些元件與其組織特異表達密切相關, 可能是其在根毛和幼根中表達所必需的。

圖4　轉基因煙草的PCR檢測Fig. 4　PCR detection of transgenic tobaccoA, B, C, D, E分別為含有啟動子缺失體p1、p2、p3、p4和全長啟動子GhRACK1-P的轉基因煙草的PCR檢測; M: 2k marker; 1～15: 轉基因煙草; 16: NC89; 17: 質(zhì)粒DNA。A, B, C, D, E represent PCR detection of transgenic tobacco containing p1, p2, p3, p4, and GhRACK1-P, respectively. M: 2k marker; 1–15: transgenic tobacco plants; 16: NC89; 17: Plasmid DNA.

3　討論

為實現(xiàn)目標基因在轉基因植物中的定時、定位表達, 降低植物體內(nèi)代謝負擔和減輕對作物本身的不利影響, 組織特異性啟動子越來越受到研究者的關注。組織特異性啟動子除了具有核心啟動子區(qū)外,還具有調(diào)控基因在組織中特異表達的調(diào)控元件, 這些組織特異表達調(diào)控元件在啟動子中的分布位置、數(shù)目和種類決定其組織表達特性。目前, 已發(fā)現(xiàn)了多個與組織特異和誘導表達相關的調(diào)控元件, 如RHEs為根毛特異表達的調(diào)控元件[14-15]; CANNTG、ACGT和GATA等順式作用元件為決定組織特異表達相關轉錄因子的結合位點[16]。

5′端缺失法是研究啟動子表達特性和調(diào)控元件功能最常用的方法之一, 利用限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶、PCR等方法從啟動子5′端上游對啟動子進行不同程度的缺失, 通過檢測缺失體驅動報告基因在轉基因植物中的表達情況來推斷啟動子不同缺失片段的結構和功能[17]。

利用PlantCare在線軟件分析了本研究獲得的GhRACK1-P啟動子上面調(diào)控元件的分布, 發(fā)現(xiàn)除含有TATA-box、CAAT-box等順式作用元件外, 含有與根特異表達有關的RootmotifTAPOX1和與表皮毛發(fā)育有關的MYB2等組織特異性調(diào)控元件。含不同啟動子缺失體轉基因煙草的GUS組織化學染色結果表明, 缺失體p1、p2、p3和p4均驅動gus基因在葉片、幼根和花粉中表達, 不具有組織特異性, 說明–644 ～ –640 bp和–1257 ～ –1253 bp處的Rootmotif-TAPOX1不是GhRACK1-P啟動子組織特異表達所必需的; 缺失啟動子上–1920 ～ –1916 bp處的RootmotifTAPOX1和–1846 ～ –1841 bp處的MYB2

元件后, GhRACK1-P啟動子的幼根及表皮毛特異表達的特性也隨之消失, 推測–1920 ～ –1916 bp處的RootmotifTAPOX1和–1846 ～ –1841 bp處的MYB2元件是幼根及表皮毛特異表達必需的。

棉纖維是從胚珠外珠被上的單個表皮細胞分化和發(fā)育而來的, 與煙草和擬南芥的表皮毛具有相似的發(fā)育機制[18-19]。鑒于棉花遺傳轉化周期比較長,轉化效率低, 研究者們經(jīng)常利用模式植物來分析纖維優(yōu)勢表達基因啟動子的表達模式, 如纖維優(yōu)勢表達基因GhRDL1啟動子在棉纖維中為優(yōu)勢表達, 在模式植物擬南芥中表現(xiàn)出表皮毛特異表達的模式[20];編碼脂轉移蛋白的基因Fsltp4在棉纖維發(fā)育中高表達, 其啟動子在轉基因煙草中表現(xiàn)出表皮毛特異表達的特性[21]。本研究利用GhRACK1-P分別驅動gus 和gfp基因在轉基因煙草中穩(wěn)定和瞬時表達, 前者結果說明GhRACK1-P驅動gus基因只在轉基因煙草的幼根及根毛中表達, 后者結果證明GhRACK1-P驅動gfp基因只在煙草葉片的表皮毛表達(未發(fā)表數(shù)據(jù)), 據(jù)此初步推測GhRACK1-P為纖維優(yōu)勢表達啟動子, 但其組織表達特性仍需在轉基因棉花中進一步研究。

圖5　不同類型轉基因煙草的GUS組織化學染色分析Fig. 5　Histochemical GUS assay of transgenic tobaccop1, p2, p3, p4, GhRACK1-P, 35S和NC89依次代表含啟動子缺失體p1、p2、p3和p4, 全長啟動子GhRACK1-P, CaMV 35S啟動子轉基因煙草和非轉基因煙草NC89的花粉、葉片和根染色情況。p1: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p1; p2: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p2; p3: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p3; p4: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p4; GhRACK1-P: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with GhRACK1-P; 35S: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with CaMV 35S promoter; NC89: no transgenic tobacco NC89.

4　結論

克隆了陸地棉纖維優(yōu)勢表達基因GhRACK1的啟動子GhRACK1-P。只有全長GhRACK1-P在轉基因煙草幼根及根毛中特異表達, 初步推測GhRACK1-P為纖維優(yōu)勢表達啟動子。

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Cloning and Deletion Analysis of GhRACK1 Promoter from Gossypium hirsutum

YANG Jiang-Tao, PANG Wei-Min, WANG Xu-Jing*, Lü Shao-Pu, TANG Qiao-Ling, and WANG Zhi-Xing*
Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Abstract:The absence of fiber specific promoter with future prospect is one of the main factors to restrict the development of genetic engineering in cotton fiber improvement. A 1987 bp length promoter sequence of Gossypium hirsutum GhRACK1 gene, which encodes receptor for activated C kinase 1 and precedantly expresses in fiber, was cloned by combination of inverse PCR and touchdown PCR method. Sequence analysis showed there were lots of promoter regulation elements such as cis acting factor and the tissue specific regulation elements. The full-length GhRACK1-P and truncations from –600 to –1 bp, –1036 to –1 bp, –1260 to –1 bp and –1620 to –1 bp were obtained by PCR method. Each of the truncations was fused with gus gene and inserted into plant expression vectors pCamBIA2300. All constructs were transformed into Nicotiana tabacum var. NC89 through Agrobacterium-mediated transformation method. GUS histochemical assay showed that the full-length GhRACK1-P promoter was expressed in root and exhibited a tissue-specific expression manner. All of the truncations were expressed in root, leaf and pollen and exhibited a constitutive expression manner. Because there is the similar developmental mechanism between cotton fiber and tobacco young root or trichome, the results indicate that GhRACK1- P may be a fiber specific expression promoter.

Keywords:Preferential expression in fiber; GhRACK1 promoter; Clone; Deletion analysis

收稿日期Received(): 2015-05-29; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡出版日期): 2015-12-18.

通訊作者*(Corresponding authors): 王旭靜, E-mail: wangxujing@caas.cn, Tel: 010-82106124; 王志興, E-mail: wangcotton@126.com, Tel: 010-82106102

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00368