肖　陽　張　弘　于向鴻　李紅丹,　原換換　蘇　亮孫　蕾,　楊宗舉,　楊建平,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081;2南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院, 河南南陽 473000;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

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如何制作分子生物學(xué)論文的圖版?

肖陽1張弘2于向鴻1李紅丹1,2原換換2蘇亮3孫蕾1,2楊宗舉1,2楊建平3,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081;2南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院, 河南南陽 473000;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

摘要:科技論文的文字寫作和圖版制作應(yīng)該相得益彰, 本文根據(jù)自己的工作和整理文章的經(jīng)驗(yàn), 介紹Excel和Photoshop軟件在處理分子生物學(xué)論文圖版時的一些基本原則與技巧。Excel是一種非常有效的軟件, 其柱狀圖不但可以用來有效地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 而且可以利用不同顏色和紋理填充, 來強(qiáng)化視覺效果, 對展示結(jié)果起到畫龍點(diǎn)睛的作用。Photoshop軟件處理組織結(jié)構(gòu)和免疫印跡等分子生物學(xué)論文圖版時, 可以通過切除、放大、對比與明暗度調(diào)節(jié)來突出主題; 但是在需要比較不同突變體背景下GFP熒光和GUS染色強(qiáng)弱時, 必須拼合成一個整體來調(diào)整。

關(guān)鍵詞:作圖技巧; 分子生物學(xué)文章; Excel; Photoshop

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170267, 31570268), 北京市自然科學(xué)基金(重點(diǎn))項(xiàng)目(6151002)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助。This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31170267, 31570268), the Natural Science Foundation of Beijing (Key Program) (6151002) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS.

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: xiaoyang@caas.cn, Tel: 010-82109683

科技論文的文字寫作和圖版制作應(yīng)為一個整體、相得益彰, 本文結(jié)合自己的工作和整理文章的經(jīng)驗(yàn), 介紹Microsoft Excel (簡稱Excel)和Adobe Photoshop (簡稱Photoshop)軟件在處理免疫印跡、GFP熒光與GUS染色等分子生物學(xué)論文圖版的一些基本原則與技巧。

1　Excel柱狀圖技巧

Excel是一種非常有效的軟件, 特別是柱狀圖,不但能有效地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 而且可以利用不同顏色、填充、紋理等, 來強(qiáng)化視覺效果, 對展示結(jié)果和印證結(jié)論, 起到畫龍點(diǎn)睛的作用。

1.1選擇合適的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)

Excel中隱藏著許多自動功能, 在作圖時比較方便操作。初學(xué)者應(yīng)該了解Excel的自動功能, 學(xué)會選擇合適的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo), 讓圖表充分體現(xiàn)自己的意圖。以樣品間分組的圖1-A可用于比較樣品1 (Sample 1)在處理1、2、3 (Treatments 1, 2, 3)間表現(xiàn)

的差異, 通常情況下, 這樣的比較沒有太大實(shí)際意義。以處理間分組的圖1-B主要體現(xiàn)在不同的處理(Treatments 1, 2, 3)中, 比較樣品(Samples 1, 2, 3)間的差異。顯然多數(shù)情況圖1-B能更好地體現(xiàn)我們的實(shí)驗(yàn)意圖。我們注意到很多學(xué)生在沒有明確自己的作圖目的, 用Excel的自動功能作了一張圖, 結(jié)果圖不達(dá)意。所以首先要明確自己作圖之目的; 然后在Excel反復(fù)調(diào)整數(shù)據(jù)的排列組合, 直到得到一個體現(xiàn)自己實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的好圖。

圖1　Excel柱狀圖不同樣品或處理間分組的比較Fig. 1　Comparison of histograms with different groups according to samples or treatments using Excel software參考文獻(xiàn)[1]圖9-E修改繪制。A: 以樣品間分組; B: 以處理間分組。The figures were drawn according to Figure 9-E of Zheng et al.[1]. Figures were grouped by samples (A) or treatments (B).

1.2Excel中黑白柱狀圖用深色填充代表需要強(qiáng)調(diào)的項(xiàng)目

圖2-A中野生型(WT)用了空白柱狀, Mutant 1 (M1)和Mutant 2 (M2)分別用了橫線和豎線柱狀, 而Double mutant (雙突變體, M1/M2)用了全黑柱狀, 從而突出了Double mutant顯著低于WT和雙親(M1和M2)的效果。圖2-B中黑暗條件下的下胚軸長度用了空白柱狀, 而紅光條件下的下胚軸長度用了全黑柱狀, 黑暗條件下各株系沒有差異, 用空白柱狀在視覺上易被忽視, 即保持了數(shù)據(jù)的完整性, 又突顯在紅光條件下phyB-GFP的表現(xiàn)(顯著抑制下胚軸伸長)。圖2-C中細(xì)胞質(zhì)中phyB-GFP蛋白的相對量用了空白柱狀, 而細(xì)胞核中phyB-GFP蛋白的相對量用了全黑柱狀, 突顯了在遠(yuǎn)紅光條件下Myc-SPA1 和GUS-COP1能夠促進(jìn)phyB- GFP由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)(**表示Myc-SPA1和GUS- COP1背景下的phyB-GFP的含量與野生型背景下親本有極顯著的差異)。

1.3Excel中黑白柱狀圖用逐漸加重填充色代表需要強(qiáng)調(diào)項(xiàng)目的重要性

圖2　Excel柱狀圖用深色填充代表需要強(qiáng)調(diào)的項(xiàng)目Fig. 2　Dark color in histogram indicating the emphatic items when using Excel softwareA: 下胚軸長度的模擬數(shù)據(jù); B: 參考文獻(xiàn)[1]圖9-A繪制, 在黑暗(Dk)和紅光(R)條件下生長5 d各株系的下胚軸長度統(tǒng)計(jì); C: 參考文獻(xiàn)[1]附圖1-B繪制, 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的phy-GFP蛋白分別與histone和HSP90蛋白的相對含量, histone和HSP90蛋白分別為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)記蛋白。A: Simulated data of hypocotyl lengths. B: Figures were drawn according to data presented by Figure 9-A of Zheng et al.[1]. Histograms of hypocotyl lengths of PHYB–GFP transgenic seedlings grown under the dark (Dk) or far-red (FR) light for 5 days. C: Figures were drawn according to data presented by Supplemental Figure 1-B of Zheng et al.[1]. Quantification of relative Myc-SPA1/ Histone (loading control for nuclear fraction) Myc-SPA1/HSP90 (loading control for cytoplasmic fraction) for each panel.

圖3為了顯示Myc-BoPHYB的轉(zhuǎn)基因在擬南芥中引起分枝增加, 圖中縱坐標(biāo)表示具有1～7個分枝的轉(zhuǎn)基因植株占各自總株數(shù)的百分比; 在圖3-B中,

我們將1個到7個分枝依此選用逐漸加深的填充圖案, 視覺上能起到輔助突出結(jié)論效果: Myc-BoPHYB的轉(zhuǎn)基因比起轉(zhuǎn)基因的背景(Col-0或phyB-9)分枝顯著增加。

1.4彩色柱狀圖中盡量用同一種顏色代表同一個樣品

在同一篇文章, 尤其是同一張圖版中, 盡量用同一種顏色代表同一個樣品, 如圖4-A、B和C中均用藍(lán)色代表轉(zhuǎn)基因株系PHYB-GFP, 用紅色代表雙突變體phyA-211/PHYB-GFP, 這樣作者的思路很容易讓讀者把握。另外, 盡量在同一篇文章中圖版、所有標(biāo)注字體、字號和格式盡量一致; 柱狀圖的粗細(xì)、間隔盡量一致; 并且盡量采用普通常見的顏色。

1.5如何標(biāo)注差異的顯著性

圖3　Excel柱狀圖用逐漸加重填充色代表需要強(qiáng)調(diào)項(xiàng)目的重要性Fig. 3　Increasingly deepen color in histogram showing item importance when using Excel software根據(jù)孫廣華等圖5[2]繪制。Myc-BoPHYB的轉(zhuǎn)基因在擬南芥中引起分枝增加。A: 修改前的圖版; B: 處理調(diào)整后的圖版。參考文獻(xiàn)[2]圖5修改繪制。The figures were drawn from data presented by Figure 5 of Sun et al.[2]. Transgenic Myc-BoPHYB enhanced branch number in Arabidopsis under short-day condition. A: Figure before modification; B: Figure after modification.

圖4　Excel柱狀圖用同一種填充色代表同一個樣品Fig. 4　The same color in histogram indicating the same item when using Excel software參考文獻(xiàn)[1]圖2-B、C和D繪制。A: 遠(yuǎn)紅光(FR)生長4 d在野生型和phyA-211突變體背景下能觀察到phyB-GFP小核體(nuclear bodys, NBs)細(xì)胞的百分率; B: 從黑暗轉(zhuǎn)導(dǎo)持續(xù)遠(yuǎn)紅光(FRc)條件1 h和2 h下幼苗的核蛋白中phy-GFP與histone的相對含量; C: 幼苗質(zhì)蛋白中phy-GFP與HSP90的相對含量(幼苗生長條件同B)。Figures were drawn according to Figure 2-A, B, and C of Zheng et al.[1]. A: Frequencies of cells with small nuclear bodies (NBs) in seedlings of PHYB-GFP in wild type (WT) or phyA-211 mutant background in FRc light. B: Quantification of relative phyB-GFP/histone protein levels in the purified nuclear fraction, indicating that nuclear import of phyB-GFP occurred in the Dk for 4 days and subsequently transferred to continuous far-red (FRc) light for 1 or 2 hours in both of the WT and the phyA-211 mutant backgrounds. C: Quantification of relative phyB-GFP/HSP90 protein levels in the nuclei-depleted soluble fraction. Seedlings were grown as in (B).

圖5-A中, 根據(jù)學(xué)生t檢驗(yàn)(Student’s t-test)結(jié)果,

用星號表示phyB-9或PHYB-GFP與野生型(Col-0);或者phyA-211/phyB-9或phyA-211/PHYB-GFP與phyA-211之間達(dá)到顯著差異水平(P < 0.05*, P < 0.01**); 如果需要在圖中指明哪兩者有顯著的差異,可以參考下圖5-B中的方式, 分別標(biāo)出了在紅光(R)或白光(WL)條件下, 雙突變體(Mutant 1/Mutant 2) 與Mutant 1或Mutant 2之間下胚軸長度達(dá)到顯著差異; 在多個樣品之間的同質(zhì)性, 我們根據(jù)F檢驗(yàn)結(jié)果, 采用下圖4-C中的方法: 相同的字母表示相互之間差異不顯著, 不同的字母表示差異達(dá)到顯著水平。t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)具體計(jì)算參考統(tǒng)計(jì)學(xué)資料。

為了配合學(xué)生t檢驗(yàn)在數(shù)據(jù)的測量時, 要把測量數(shù)據(jù)分成3個以上的組, 求每組平均數(shù)及組間的方差,這樣就可以進(jìn)行學(xué)生t檢驗(yàn)。舉例說明: 把在3行中測量60株株高, 分成每行1組, 每組20株; 如果僅是單行需要測量60株, 可以把單行平分成3截, 每截測量20株。其他分組策略類推。

圖5　柱狀圖中標(biāo)注差異顯著性的常見3種方法Fig. 5　Three methods for marking significant differences in histogramA: 參考文獻(xiàn)[1]圖3-A繪制。在黑暗(Dk)和遠(yuǎn)紅光(FR)生長5 d各株系下胚軸長度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù); B: 模擬數(shù)據(jù)示紅光(R)和白光(WL)生長4 d單突變體Mutant 1和Mutant 2與雙突變體Mutant 1/Mutant 2的下胚軸長度; C: 模擬數(shù)據(jù)示(WL)生長4 d Mutant 1 和Mutant 2與Mutant 1/Mutant 2的幼苗表型與下胚軸長度。A: The figure was drawn according to Figure 3-A of Zheng et al.[1]. B: Simulated data of hypocotyl lengths of seedlings of Mutant 1, Mutant 2, and double mutant Mutant 1/Mutant 2 in red (R) light and white light (WL). C: Simulated data of morphology hypocotyl lengths of seedlings of Mutant 1, Mutant 2, and Mutant 1/Mutant 2 in WL.

2　免疫印跡利用Photoshop的作圖技巧

2.1免疫印跡圖版處理的一般原則

免疫印跡(Immunoblot)顯色后, 將膜掃描入電腦(注意用NBT/BCIP顯色時, 有時濕膜的掃描效果更好, 濕膜掃描時應(yīng)注意保護(hù)掃描儀), 盡量使用較高的像素以確保圖片的質(zhì)量; 在Photoshop中新建一個文件, 大約20 cm × 20 cm (一般為灰色), 將掃描圖像拖入新建文件中, 文件命名保存, 見圖6-A;然后在“顯示額外”的方格中, 把圖片旋轉(zhuǎn)、縮放到合適大小, 切去不需要的部分, 見圖6-B; 主要通過對比度并結(jié)合亮度的調(diào)整, 使得條帶清晰、背景較淺,見圖6-C; 對比度和亮度會影響對條帶的差異程度產(chǎn)生一定的影響, 一定要適當(dāng); 積極實(shí)踐、摸索、總結(jié)、提高; 由于免疫印跡圖版邊界較淺, 多數(shù)文章喜歡在圖版的邊緣加上線條, 起到突出圖版的效果,見圖6-D; 給圖版加上必要的信息和注釋, 大功告成, 見圖6-E。

2.2免疫印跡條帶過淡反差較小時的作圖技巧

免疫印跡得到清晰反差大條帶的方法: (1)用較好的凝膠系統(tǒng); (2)適當(dāng)增加上樣量; (3)轉(zhuǎn)膜低電壓,延長轉(zhuǎn)膜時間; (4)一抗4℃過夜; (5)顯色前用底物buffer洗膜; (6)用較低濃度的顯色buffer顯色(1/3～1/5); (7)顯色過程中更換新的顯色buffer。一旦上述措施不奏效, 不得不使用條帶過淡反差較小的免疫印跡結(jié)果時, 如圖7-A, 我們采用以下的措施作圖: (1)將圖A拖入Photoshop中; (2)將圖7-A的亮度調(diào)到-50, 得到圖7-B; (3)將圖7-B的對比度調(diào)到+100, 得到圖7-C; (4)重復(fù)步驟(2)～(3), 即將圖7-C的亮度調(diào)到-50, 再將對比度調(diào)到+100, 得到圖7-D; (5)將圖7-D對比度調(diào)到+20, 得到圖7-E; (6)可將圖E轉(zhuǎn)成黑白圖版, 再按照上述2.1 (圖6)的步驟, 完成圖版, 見圖7-F。想要發(fā)表高水平的文章, 盡量考慮重復(fù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR以及分子標(biāo)記銀染的圖版處理,也可以參考該部分免疫印跡的作圖技巧。

2.3如何對免疫印跡結(jié)果量化

3.增值稅優(yōu)惠。煤炭企業(yè)所涉及到的整個流程是十分復(fù)雜的，在進(jìn)行煤炭加工的過程中也會產(chǎn)生煤矸石、煤泥等固體廢物，不能用作銷售。但是這些產(chǎn)生的固體廢物可以用作煤炭企業(yè)下設(shè)的電力、熱力公司作為燃料，這樣不僅可以節(jié)約資源、減輕污染，還可以產(chǎn)生額外的效益。我國對這部分增值稅實(shí)行即征即退50%的政策。

圖6　免疫印跡圖版對比度和亮度的調(diào)節(jié)Fig. 6　Adjustment of contrast and brightness on immunoblot membrane

圖7　免疫印跡條帶過淡反差較小圖版對比度和亮度的調(diào)節(jié)Fig. 7　Adjustment of contrast and brightness on immunoblot membrane with weak bands

圖8　免疫印跡條帶的量化Fig. 8　Band quantification of immunoblot results參考文獻(xiàn)[1]圖5-A和圖7-A繪制。A: 從黑暗轉(zhuǎn)到持續(xù)遠(yuǎn)紅光(FR)條件15、30、60和120 min下, 在phyB-9、Col-0和PHYB-GFP背景下的核蛋白中Myc-SPA1與Histone的免疫印跡分析; B: 對應(yīng)于A用ImageJ軟件量化后Myc-SPA1與histone的相對含量。Figures were drawn according to Supplemental Figure 5-A and Figure 7-A of Zheng et al.[1]. A: Immunoblots analysis of Myc-SPA1and Histone in the seedlings in phyB-9, Col-0, and PHYB-GFP backgrounds grown in the dark (Dk) for 4 days and subsequently transferred to far-red (FR) light for 15, 30, 60, or 120 min. B: Quantification of relative Myc-SPA1/histone protein levels corresponding to (A) using the ImageJ software.

對免疫印跡條帶進(jìn)行量化, 可以用具體數(shù)字代替文字描述, 會使結(jié)果更具說服力。由免疫印跡膜(如圖8-A)變成具體的圖表(如圖8-B), 多數(shù)雜志會要求有3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。大家先看例子: 我們試圖證明在遠(yuǎn)紅光(FR)條件下擬南芥光敏色素B (phyB)能促進(jìn)SPA1的核聚集, 我們在3種phyB水平的背景(缺失突變體phyB-9、野生型Col-0和過量表達(dá)PHYB-GFP)下比較了轉(zhuǎn)基因Myc-SPA1在細(xì)胞核中的積累。圖8-A是3次重復(fù)免疫印跡的結(jié)果, 將Myc-SPA1和核蛋白對照Histone條帶量化, 二者比值的相對值做成圖8-B。在圖8-B中我們清晰可見,隨著phyB的增加, 從phyB-9、野生型Col-0和過量表達(dá)PHYB-GFP三種背景下, Myc-SPA1的核聚集逐級增強(qiáng)。可見, 圖8-B比圖8-A的效果會好很多, 并且文章中更容易敘述。Myc-SPA1和Histone條帶的灰度值用ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/)量化, 黑暗中(Dk)二者的比值設(shè)為100, 其他條帶的量化值通過與黑暗中的比例計(jì)算而來。請按照相關(guān)軟件和文獻(xiàn)[1]和[4]操作。

2.4Co-IP免疫印跡應(yīng)注意的事項(xiàng):

Co-IP是證明蛋白間互作, 并形成復(fù)合體的經(jīng)典方法。Co-IP可以用下列樣品: 煙草葉片混合注射樣品, 如圖9-A; 雙轉(zhuǎn)基因株系樣品, 如圖9-B;也可以用2個單轉(zhuǎn)基因株系的混合液。Co-IP免疫印跡應(yīng)注意的事項(xiàng): (1)認(rèn)真配制Co-IP反應(yīng)樣品提取液, 有時需要加上一些蛋白降解的抑制劑; (2)反應(yīng)樣品液(稱為Total或Input)和沉淀(IP)分別需要做兩種蛋白的免疫印跡, 如圖9的α-Myc和α-GFP; (3) Co-IP要設(shè)置合理的陰性對照, 如圖9-A中Myc-SPA1和PHYB-CT548-GFP的煙草葉單個載體注射樣品為陰性對照, 如圖9-B中單轉(zhuǎn)基因株系PHYB-GFP為陰性對照。

圖9　Co-IP免疫印跡圖版的處理Fig. 9　Adjustment of immunoblot results on Co-IP results Co-IP免疫印跡分析圖版參考文獻(xiàn)[1]圖6-C和F繪制。A: 煙草葉片注射樣品Myc-SPA1、PHYB-CT548-GFP和Myc-SPA1/PHYB-CT54-GFP; B: 遠(yuǎn)紅光(FR)或紅光(R)下的轉(zhuǎn)基因株系PHYB-GFP和雙轉(zhuǎn)基因株系PHYB-GFP/Myc-SPA1。Figures were drawn according to Figure 6-C and D of Zheng et al.[1]A: In vivo co-immunoprecipitation (co-IP) of phyB-CT548 by Myc–SPA1 in Nicotiana benthamiana plants were co-infiltrated with either or both of 35S-driven Myc-SPA1 and PHYB-CT548-GFP in EHA105 and then transferred to FR light for 3 days. B: In vivo co-IP of phyB-GFP by Myc-SPA1 in PHYB-GFP or PHYB–GFP/Myc-SPA1 seedlings under FR or R light.

3　蛋白熒光與GUS染色圖版處理技巧

3.1調(diào)整GFP圖版明暗和對比度的原則: 在兩種背景下比較GFP熒光強(qiáng)度時, 必須拼合為一個整體, 一起調(diào)整

圖10中, 在使用GFP熒光, 來比較轉(zhuǎn)基因PAR1-GFP在野生型和cop1-4突變體兩種背景下的PAR1-GFP蛋白積累的差異時: 可以先將相同條件拍照的圖版按圖10-A的形式整理好; 如果圖版確實(shí)有些暗,可以將圖版在Photoshop中拼合成一個整體, 然后調(diào)整明暗和對比度到合適的程度; 圖10-B顯示, 無論是黑暗或由黑暗轉(zhuǎn)入不同的光照條件下, 在cop1-4突變體比在野生型背景下均能積累更多的PAR1-GFP蛋白, 間接證明COP1介導(dǎo)PAR1的降解。

3.2蛋白熒光互作作圖技巧

蛋白熒光證明2個蛋白互作和是否形成復(fù)合體的經(jīng)典方法, 包括GFP、YFP和RFP; BIFC和Luferase雙分子互補(bǔ); 免疫熒光等?？梢杂孟铝袠悠? 煙草葉片注射(快速); 雙轉(zhuǎn)基因株系(材料豐富); 原生質(zhì)體(真實(shí)); 洋蔥表皮細(xì)胞(效果好)。蛋白熒光應(yīng)注意的事項(xiàng): (1)DAPI細(xì)胞核染色; (2)每一種熒光單獨(dú)的對照, 例如Myc-SPA1和PHYB-GFP; (3)有時需要空載體的對照(圖11)。

GUS染色是啟動子表達(dá)部位分析和蛋白定位的常用方法。GUS染色應(yīng)注意的事項(xiàng): (1)蛋白需要核聚集的應(yīng)采用DAPI細(xì)胞核染色, 如圖12; (2)需要在兩種不同的遺傳背景下比較某一蛋白核聚集的差異, 應(yīng)選用相同的部位, 并且染色、脫色應(yīng)該盡可能一致; (3)照片拍攝的參數(shù)、圖版處理的方法應(yīng)該一致。

4　其他圖版處理

4.1如何畫擬南芥插入T-DNA突變體基因圖

以SPA2(SPA1-RELATED 2)基因?yàn)槔? 進(jìn)入The Arabidopsis Information Resource (https://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站。在Search欄中, 填入基因號, 如SPA2: AT4g11110, 雙擊Locus中下方的基因號: AT4g11110, 即進(jìn)入SPA2詳細(xì)描述網(wǎng)頁。下載Map Detail Image中的Protein Coding Gene Models圖, 如下圖13-A。在PPT中拖入下載圖片, 調(diào)整到理想大小, 在下方用黑框或者下調(diào)畫出基因模式圖, 以及T-DNA插入位置, 如下圖13-B。也可以從PPT中拷到Photoshop軟件中進(jìn)一步處理。

圖10　需要比較GFP熒光強(qiáng)度圖版的處理Fig. 10　Adjustment of GFP images when strengthening fluorescence intensity根據(jù)Zhou等[3]圖5-C繪制。各種光處理野生型和cop1-4突變體背景中下胚軸和根內(nèi)PAR1-GFP熒光強(qiáng)弱的比較, A: 修改前的圖版; B: 處理調(diào)整后的圖版。The figures were drawn according to Figure 5-C of Zhou et al.[3]. Fluorescence images of PAR1-GFP in hypocotyl or root cells showing that the seedlings of PAR1-GFP/cop1-4 double mutant accumulated much more PAR1-GFP protein in the nucleus than these in the WT background during dark-light or dark-light-dark transitions. A: Figure before modification; B: Figure after modification.

圖11　蛋白熒光互作圖版的處理Fig. 11　Adjustment of fluorescence images showing protein-protein interaction根據(jù)Zheng等[1]附圖6-B繪制。Myc-SPA1和phyB-GFP在擬南芥細(xì)胞核中的共定位; phyB-GFP為正常GFP觀察; Myc-SPA1為免疫熒光觀察, 樣品先用anti-Myc (鼠單克隆抗體IgG)抗體標(biāo)記,然后用TRITC交聯(lián)的anti-mouse IgG (R)雜交; DAPI染色示細(xì)胞核的位置。The figures were drawn according to Figure 6-B of Zheng et al.[1]. Co-localization of phyB and SPA1 in the nucleus of Arabidopsis cells. Nuclei were isolated from seedlings of PHYB-GFP or PHYB-GFP Myc-SPA1 grown in the dark (Dk), FR light or R light for 4 days. PhyB-GFP fluorescence was examined by GFP protein fluorescence. For anti-Myc immunofluorescence, samples were probed with anti-Myc (mouse monoclonal IgG) followed by TRITC-conjugated anti-mouse IgG (R). Nuclei positions were confirmed by 4’,6-diamidino-2-phenylindole staining (data not shown).

4.2為了突顯雙突變體, 將其置于2個親本中間

基因功能研究中, 往往需要構(gòu)建雙突變體, 其用途是比較一個突變體或者轉(zhuǎn)基因株系在不同突變體背景下的遺傳表型和分子、生化鑒定。在作圖中,把雙突變體放在2個親本中間, 有助于突出雙突變體與親本的差異。例如: 下圖14-A, Col和RLD分別是單突變體cop1-6和spa1-3對應(yīng)的野生型, 雙突變體spa1-3/cop1-6比雙親(cop1-6和spa1-3)更矮、花青素積累更多(顏色更深)。圖14-B中, COP1-OE/ SPA1-OE極其顯著的高于COP1-OE和SPA1-OE。(雙突變體有的文章中要求有一個空格, 而不是斜線, 如spa1-3/cop1-6, 但是需要用斜體)。如果有2個以上的雙突變體一同展示, 其中共用一個親本(GFP-HFR1, B4)的話, 這個親本放在前面, 如下圖14-C。當(dāng)然對應(yīng)的野生型(WT)和GFP-HFR1轉(zhuǎn)基因的突變體背景(hfr1-201), 需要放在恰當(dāng)?shù)奈恢蒙?。同一種處理, 盡量在同一種放大倍數(shù)拍攝, 這樣給定一個標(biāo)尺(scale bar)即可, 如下圖10-B和C中的FR、R、B; 如果不能, 每張照片需要放上一個標(biāo)尺,如下圖14-A。

4.3圖版通過切除、放大、對比與明暗度調(diào)節(jié)突出主題

每次實(shí)驗(yàn)盡量選用相似的背景、明暗和對比度,準(zhǔn)備一批圖版, 反復(fù)對比挑選理想的圖版; 原圖一般在大小、角度和細(xì)節(jié)上不一定十全十美(圖15-A),通過切除、旋轉(zhuǎn)、放大/縮小、對比度、明暗度的調(diào)節(jié), 達(dá)到去除多余、雜亂的背景和突出主題的效果(圖15-B)?？萍嘉墨I(xiàn)要求真實(shí)反映客觀事實(shí), 而非提供漂亮的照片, 任何圖片必須清晰、自然、客觀和為主題服務(wù), 除以上提到的方法以外, 其余的方法應(yīng)嚴(yán)格禁止: 如噴涂、拼接。

圖12　GUS染色圖版的處理Fig. 12　Adjustment of GUS staining images根據(jù)Zheng等[1]附圖8-A繪制。黑暗和遠(yuǎn)紅光條件下GUS-COP1在野生型(No-0)和spa1-3背景下核聚集的比較, 上層為GUS染色(黑色箭頭), 下層為DAPI染色示細(xì)胞核的位置(白色箭頭)。The figures were drawn according to Figure 8-A of Zheng et al.[1]. Nuclear accumulation of GUS–COP1 in the WT (No-0) and in the spa1-3 background in the darkness and under far-red (FR) light. The upper panels present GUS-stained images (black arrows) and the lower panels display DAPI staining (white arrows) of the corresponding image to show the positions of the nuclei.

圖13　擬南芥SPA2基因插入T-DNA突變體基因圖Fig. 13　Diagram of the genomic structure of SPA2 gene and the T-DNA insertion

圖14　突顯雙突變體的位置是置于2個親本中間Fig. 14　Double mutants located between two parental lines for strengthening their importances圖版分別根據(jù)Saijo等[5]圖2-A、Yang和Wang等[6]圖3-C繪制、Yang等[7]圖7-A繪制。A: cop1-6和spa1-3單突變體、對應(yīng)的野生型(Col和RLD)與雙突變體spa1-3/cop1-6在遠(yuǎn)紅光(FR)下生長4 d的表型; B: WT、COP1-OE、SPA1-OE和COP1-OE/SPA1-OE在遠(yuǎn)紅光(FR)和藍(lán)光(B)下生長4 d的表型; C: GFP-HFR1(株系B4)的形態(tài)在野生型與cop1-4和cop1-6背景下的比較。Figures were drawn according to Figure 2-A of Saijo et al.[5], Figure 3-C of Yang and Wang[6], Figure 7-A of Yang et al.[7], respectively. A: Morphologic comparison of double mutant of spa1-3/cop1-6 with the WT, Col and RLD, single mutant, spa1-3 and cop1-6 grown under FR light for 4 days. B: Morphologic comparison of double transgenic over-expression line of COP1-OE/SPA1-OE with WT, COP1-OE and SPA1-OE grown under FR light for 4 days. C: Morphologic comparison of transgenic GFP-HFR1 (line B4) in WT background with cop1-4 or cop1-6 background.

4.4酵母雙雜液體測試結(jié)果的作圖技巧

酵母雙雜是證明2個蛋白互作的經(jīng)典方法之一,可以做平板測試(plate assay)和液體測試(liquid assay), 前者通過顯色的深淺來表示2個蛋白互作的強(qiáng)弱, 后者是通過測定多個單克隆酶活來計(jì)算2個蛋白互作強(qiáng)度的相對值。酵母雙雜不但能證明2個蛋白間互作, 還能進(jìn)一步明確2個蛋白間的互作區(qū)段。下面我們通過具體事例來說明(圖16): (1)為了證明擬南芥光敏色素B (phyB)與SPA1的互作, 將phyB-CT548構(gòu)建到DNA結(jié)合區(qū)段的載體LEX中, 而SPA1的不同功能區(qū)段連接到DNA激活區(qū)段載體GAL4中; (2)載體LEX與GAL4-SPA1的不同功能區(qū)段作為陰性對照, 進(jìn)行液體測試; 我們將SPA1的不同功能區(qū)段放在左邊, 而液體測試的β-半乳糖苷酶(β-galactocidase)相對酶活性放在右邊, 并且左右圖間通過調(diào)整大小形成對應(yīng), 這樣很容易得出結(jié)論phyB的C端主要與SPA1的C端互作。

圖15　圖版通過切除、放大、對比與明暗度調(diào)節(jié)突出主題Fig. 15　Image adjustment through excision, magnification, contrast and brightness for strengthening its importanceA: 修改前的圖版; B: 處理調(diào)整后的圖版。A: Figures before modification; B: Figures after modification.

圖16　酵母雙雜液體測試結(jié)果的圖版處理Fig. 16　How to display the results of liquid assay of yeast two-hybrid根據(jù)Zheng等圖6-A[1]繪制。The figure was drawn according to Figure 6-A of Zheng et al.[1].

References

[1] Zheng X, Wu S, Zhai H, Zhou P, Song M, Su L, Xi Y, Li Z, Cai Y, Meng F, Yang L, Wang H, Yang J. Arabidopsis phytochrome B promotes SPA1 nuclear accumulation to repress photomorphogenesis under far-red light. Plant Cell, 2013, 25: 115–133

[2] 孫廣華, 原換換, 樊小聰, 顧?？? 宋梅芳, 肖陽, 孟凡華, 郭林, 楊青華, 詹克慧, 楊建平. 甘藍(lán)光敏色素B基因克隆及在擬南芥異源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48: 4417–4427

Sun G H, Yuan H H, Fan X C, Gu H K, Song M F, Xiao Y, Meng F H, Guo L, Yang Q H, Zhan K H, Yang J P. Molecular cloning and Arabidopsis ectopic expression of a phytochrome B gene from Brassica oleracea. Sci Agric Sin, 2015, 48: 4417–4427 (in Chinese with English abstract)

[3] Zhou P, Song M, Yang Q, Su L, Hou P, Guo L, Zheng X, Xi Y, Meng F, Xiao Y, Yang L, Yang J. Both PHYTOCHROME RAPIDLY REGULATED1 (PAR1) and PAR2 promote seedling photomorphogenesis in multiple light signaling pathways. Plant Physiol, 2014, 164: 841–852

[4] Saijo Y, Zhu D, Li J, Rubio V, Zhou Z, Shen Y, Hoecker U, Wang H, Deng X W. Arabidopsis COP1/SPA1 complex and FHY1/ FHY3

associate with distinct phosphorylated forms of phytochrome A in balancing light signaling. Mol Cell, 2008, 31: 607–613

[5] Saijo Y, Sullivan J A, Wang H, Yang J, Shen Y, Rubio V, Ma L, Hoecker U, Den X W. The COP1-SPA1 interaction defines a critical step in phytochrome A-mediated regulation of HY5 activity. Genes Dev, 2003, 17: 2642–2647

[6] Yang J P, Wang H Y. The central coiled-coil domain and carboxyl-terminal WD-repeat domain of Arabidopsis SPA1 are responsible for mediating repressing of light signaling. Plant J, 2006, 47: 564–576

[7] Yang J, Lin R, Sullivan J, Hoecker U, Liu B, Xu L, Deng X W, Wang H. Light regulates COP1-mediated degradation of HFR1, a transcription factor essential for light signaling in Arabidopsis. Plant Cell, 2005, 17: 804–821

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160104.1427.004.html

How to Prepare Figures in Articles of Molecular Biology?

XIAO Yang1, ZHANG Hong2, YU Xiang-Hong1, LI Hong-Dan1,2, YUAN Huan-Huan2, SU Liang3, SUN Lei1,2, YANG Zong-Ju1,2, and YANG Jian-Ping3,*1Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2Nanyang Vocational College of Agriculture, Nanyang 473000, China;3Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Abstract:Proper figures are beneficial to our article presentation. Basing on our knowledge and working experience, we introduced some essential skills of figure preparation in articles of molecular biology using Excel and Photoshop softwares in this article. Excel is an effective software not only for presentation of our experiment data, but also help us to make the finishing point when using different infilling colors and textures to aggrandize visual effects in Excel histogram. When processing figures of structure and immunoblot result, it can give prominence to subject through excision, enlargement, and adjustment of contrast and brightness using Photoshop software. When the strength of GFP fluorescence and GUS staining needs to be compared in different backgrounds, it is necessary to piece and adjust figures together as a whole one.

Keywords:Figure preparation; Article of molecular biology; Excel; Photoshop

收稿日期Received(): 2015-12-16; Accepted(接受日期): 2015-12-22; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2016-01-04.

通訊作者*(Corresponding author): 楊建平, E-mail: yangjianping02@caas.cn, Tel/Fax: 010-82105859

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00456