侯天龍，包旦奇，李澤君，劉芹防，劉煥奇

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018）

·研究論文·

流感病毒M1蛋白與M2蛋白相互作用以及其在病毒出芽中的作用

侯天龍1,2，包旦奇3，李澤君2，劉芹防2，劉煥奇1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018）

流感病毒為囊膜病毒，以出芽的方式釋放病毒。M1蛋白是流感病毒的基質(zhì)蛋白，在維持病毒顆粒形態(tài)與病毒的致病性中發(fā)揮重要作用。M2蛋白是離子通道蛋白，在病毒出芽過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示M1蛋白與M2蛋白存在相互作用，但是這種互作在病毒出芽中的功能尚不清楚。根據(jù)M1蛋白的結(jié)構(gòu)，M1蛋白分成N端、C端和中間區(qū)域3個區(qū)域，與M2蛋白相互作用的區(qū)域也不清楚。本文利用雙分子熒光互補(bǔ)實驗與病毒出芽實驗方法研究了M1蛋白與M2蛋白互作的區(qū)域及這種互作在病毒出芽中的作用。研究結(jié)果顯示，M2蛋白通過與M1蛋白的N端1～160個氨基酸相互作用，從而幫助M1蛋白出芽；M1蛋白的1～20 氨基酸與140～160氨基酸在決定M1蛋白的穩(wěn)定性與功能發(fā)揮中具有重要作用，缺失這2個氨基酸序列可導(dǎo)致M1蛋白N端1～160個氨基酸蛋白不穩(wěn)定，并不能與M2蛋白互作。本研究揭示了3H1N1流感病毒M1蛋白與M2蛋白互作功能區(qū)域、以及他們之間相互作用在流感病毒出芽中發(fā)揮的重要作用。

流感病毒；M1蛋白；M2蛋白；出芽

流感病毒為正黏病毒科、流感病毒屬的有囊膜病毒，基因組分為分節(jié)段的、單股負(fù)鏈的RNA（SsRNA）[1]。流感病毒中存在核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（M），根據(jù)其抗原性的不同，可將流感病毒劃分為A、B、C型。通過對流感病毒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)其擁有多個亞型。目前已經(jīng)鑒定的HA亞型有18種，NA亞型11種，常見亞型有H1N1、H5N1、H7N9、H9N2等。H17N10與H18N11病毒是從蝙蝠中新發(fā)現(xiàn)的A型流感病毒[2]。

流感病毒基因組包含8個分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，至少編碼12～13種蛋白，包括HA、NA、NP、MP、PB2、PB1、PA、NP、NS等蛋白。流感病毒是具有囊膜包被的RNA病毒，形態(tài)多為球形結(jié)構(gòu)，大小在80～120 nm，也存在數(shù)千納米的絲狀。病毒囊膜出自于宿主細(xì)胞脂膜，包括糖蛋白、類脂和內(nèi)膜蛋白共3層。糖蛋白形成HA分子，其形態(tài)為棒狀三聚體構(gòu)成；NA分子由四聚體構(gòu)成，其形態(tài)為蘑菇狀[3]。M1蛋白是流感病毒顆粒中含量最多的蛋白之一，由252個氨基酸組成，包含3個區(qū)域：N端、C端與中間區(qū)域[4]。M1蛋白在病毒囊膜下形成一個病毒基質(zhì)層，在維持病毒顆粒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)方面起著重要的作用[5]。M1蛋白也具有多重功能，與病毒基因組（RNPs）相互作用從而影響其出核過程，在病毒的復(fù)制過程中起到十分重要的作用[6]，但是M1蛋白在流感病毒出芽過程中的具體作用尚存在爭議[7]。

研究表明M1蛋白必須與M2蛋白相互作用才能完成M1蛋白的出芽[8]，但是M1蛋白與M2蛋白相互作用的功能區(qū)域尚不清楚[9]。M2蛋白是流感病毒顆粒中的一個離子通道蛋白[10]，在病毒感染早期，M2蛋白通過調(diào)節(jié)病毒顆粒中的pH值，從而使病毒釋放其基因組RNPs到感染的細(xì)胞中。在病毒感染后期，M2蛋白在流感病毒出芽后期，剪切細(xì)胞膜進(jìn)一步釋放病毒中也起到重要作用[11]。M2蛋白由97個氨基酸組成，在膜上形成同源四聚體[12]。最近研究證明M2蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)，特別是分子螺旋46～62位殘基，可能在病毒的裝配和出芽中扮演著重要的作用[8]。目前，M1蛋白與M2蛋白相互作用的功能區(qū)域以及這種互作在病毒出芽中的作用尚不清楚，本研究利用雙分子熒光互補(bǔ)實驗（bimolecular fluorescence complementation，BIFC）與病毒出芽實驗（viruslike particle，VLP）對此問題進(jìn)行探索研究。

1 材料方法

1.1 細(xì)胞與毒株 293T細(xì)胞、A/California/04/2009（H1N1）由上海獸醫(yī)研究所動物流感病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊保存。

1.2 載體與主要試劑 VN、VC、3Flag與2HA真核表達(dá)載體為本實驗室保存；PCR試劑購自大連寶生物有限公司（TaKaRa）；限制性內(nèi)切酶Xho I與Not I，T4 DNA連接酶購自NEB公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、Opti-MEM購自Gibco公司；Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase購自諾唯贊公司；QIA quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒購自北京華綠源科技有限公司；大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒購自QIAGEN公司；轉(zhuǎn)染試劑Mirus購自Bio公司。

1.3 雙分子熒光互補(bǔ)實驗

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建 提取H1N1流感病毒基因組RNA，提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA待下一步研究使用。利用特異性引物擴(kuò)增M1、M1-1-160、M1-1-140、M1-20-160、M1-60-252、M2基因片段，然后將這些片段克隆進(jìn)入BIFC系統(tǒng)中工作VC質(zhì)粒的Xho I與Not I酶切位點之間，命名為VC-M1、VC-M1-1-160、VC-M1-1-140、VC-M1-20-160、VC-M1-60-252；擴(kuò)增的M2片段需要單獨克隆于BIFC系統(tǒng)中工作VN質(zhì)粒的Xho I與Not I酶切位點之間，將其命名為VN-M2。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用腔室載玻片培養(yǎng)293T細(xì)胞，培養(yǎng)時間為12～20 h。將用于BIFC系統(tǒng)中構(gòu)建成功的質(zhì)粒VC-M1、VC-M1-1-160、VC-M1-1-140、VC-M1-20-160、VC-M1-60-252分別（100 ng/質(zhì)粒）與VN-M2質(zhì)粒（100 ng）利用轉(zhuǎn)染試劑Mirus共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.3.3 細(xì)胞固定、染色與觀察 轉(zhuǎn)染后20 h，棄掉上清，PBS清洗細(xì)胞。棄掉PBS洗液，再加入4%多聚甲醛固定為10 min。固定結(jié)束后棄掉固定液，用DAPI染料對細(xì)胞進(jìn)行核染色5 min。棄掉染液用PBS清洗細(xì)胞后在載玻片上滴加甘油，蓋玻片固定封片。固定好的封片用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4 出芽實驗（virus-like particle，VLP）

1.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建 在VLP出芽實驗中，利用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增M1、M1-1-160、M1-1-140、M1-20-160、M1-60-252、M2基因片段，將擴(kuò)增完成的這些片段克隆進(jìn)入3Flag載體的Xho I與Not I酶切位點之間，命名為3Flag -M1、3Flag -M1-1-160、3Flag -M1-1-140、3Flag -M1-20-160、3Flag -M1-60-252。擴(kuò)增的M2片段克隆于2HA真核表達(dá)質(zhì)粒的Xho I與Not I酶切位點之間，將其命名為2 HA -M 2。1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)293T細(xì)胞20 h。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒3Flag-M1、3Flag-M1-1-160、3Flag-M1-60-252（10 μg/質(zhì)粒）分別與2HA-M2質(zhì)粒（10 μg）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.4.3 VLP純化 轉(zhuǎn)染后48 h分別收集細(xì)胞上清液與細(xì)胞，細(xì)胞上清液4℃、500×g離心30 min。離心后吸取上清移至新的離心管，4℃、超速離心5 h。棄掉上清，僅留底部200 μL，將沉淀溶解后凍存于-80℃冰箱備用。293T細(xì)胞用800 μL RIPA的裂解液進(jìn)行裂解，裂解條件為4℃、10 min。裂解完成后收集于1.5 mL離心管中，凍存于-80℃冰箱中。

1.4.4 Western blot 取VLP純化物與細(xì)胞裂解液各20 μL，分別加入2×SDS上樣緩沖液20 μL，100℃煮沸10 min，使蛋白樣品充分變性，進(jìn)行12%SDSPAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，取出蛋白凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（恒流250 mA、2 h）。

1.4.5 封閉、抗體孵育及顯色 蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，用PBST溶液配制5%脫脂奶，搖床室溫封閉2 h。孵育結(jié)束棄掉脫脂奶，PBST清洗后，用抗Flag或HA標(biāo)簽蛋白的鼠源抗體（1∶1000稀釋）室溫孵育2 h，再用PBST漂洗膜3次（10 min/次），洗去未結(jié)合抗體。加入HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG的二抗（1∶2000稀釋）室溫孵育2 h，PBST漂洗膜3次（10 min/次），洗去未結(jié)合的二抗。漂洗結(jié)束進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 M1蛋白通過N端1～160氨基酸與M2蛋白相互作用通過雙分子熒光互補(bǔ)實驗（BIFC）研究M1蛋白和M2蛋白之間的相互作用，我們將VC-M1和VN-M2兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染20 h后觀察293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有胞漿和細(xì)胞膜上有綠色熒光，這說明了在M1蛋白和M2蛋白之間存在較強(qiáng)的相互作用（圖1）。

為了進(jìn)一步研究M1蛋白與M2蛋白相互作用的區(qū)域，我們將M1蛋白分為2個區(qū)域，即1～160氨基酸的結(jié)構(gòu)功能區(qū)和60～252氨基酸的C端區(qū)域，并將 2個區(qū)域克隆到BIFC系統(tǒng)中，將VC-M1-1-160、VCM1-60-252分別與VN-M2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后20 h，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)VC-M1-1-160組在觀察中可清晰見到綠色熒光（圖2），但在VC-M1-60-252組中幾乎無熒光表達(dá)（圖2）。結(jié)果說明，M1蛋白N端的1～160的氨基酸殘基能與M2蛋白相互作用，而C端的60～252氨基酸殘基不與M2蛋白作用。

圖1 利用BIFC檢測M1蛋白與M2蛋白相互作用Fig.1 Interaction between M1 and M2 protein in 293T cell by using BIFC system

為了驗證是否存在更小的作用區(qū)域，即對M1蛋白與M2蛋白相互作用區(qū)進(jìn)行精細(xì)定位，將M1蛋白的1～160區(qū)域N端與C端各截短20個氨基酸，分別構(gòu)建質(zhì)粒VC-M1-1-140和VC-M1-20-160。將VCM1-1-140、VC-M1-20-160和VN-M2分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后分析BIFC結(jié)果，結(jié)果顯示這兩組中都沒有產(chǎn)生綠色熒光，說明M1蛋白N端的1～160氨基酸殘基是與M2蛋白相互作用的最小功能區(qū)域（圖2）。

圖2 利用BIFC檢測M1蛋白不同區(qū)域與M2蛋白相互作用Fig.2 Interaction between truncated M1 and M2 protein in 293T cell by using BIFC system

2.2 M1蛋白與M2蛋白相互作用在出芽中的作用 前期結(jié)果已證明M1蛋白通過N端的160個氨基酸殘基與M2蛋白相互作用，為了研究這個相互作用在蛋白出芽中的功能，用3Flag-M1質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，或者3Flag-M1和2HA-M2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞上清進(jìn)行VLP純化。Western blot檢測結(jié)果顯示，單獨轉(zhuǎn)染3Flag-M1的細(xì)胞上清的VLP中檢測不到M1蛋白，說明M1蛋白顯然不具備單獨出芽能力（圖3）。而對3Flag-M1和2HA-M2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)兩種蛋白都可以在上清中被檢測到，說明M2蛋白可以協(xié)助M1蛋白完成出芽，釋放到細(xì)胞上清中。

圖3 M1蛋白與M2蛋白共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞蛋白出芽情況Fig.3 Budding of M1 proteins with M2 protein in 293T cells

2.3 M1的N端1～160氨基酸與M2相互作用在出芽中的作用 BIFC實驗已經(jīng)驗證M1-1-160的區(qū)域是與M2蛋白相互作用的，那么在病毒出芽過程中，M2蛋白是否通過與M1蛋白的1～160區(qū)域互作而幫助其出芽的尚不清楚。將3Flag-M1-1-140、3Flag-M1-20-160、3Flag-M1-1-160、3Flag-M1-60-252質(zhì)粒分別與2HA-M2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后檢測其細(xì)胞上清VLP和細(xì)胞裂解液中蛋白水平。結(jié)果表明M2蛋白無論在上清還是裂解液中表達(dá)水平都很高，但是截斷M1蛋白中只有M1-1-160在細(xì)胞上清中被檢測到。結(jié)果證明，M1蛋白N端1～160氨基酸是與M2蛋白相互作用的功能區(qū)域，并且在病毒出芽過程中，M2蛋白通過與M1蛋白N端1～160氨基酸區(qū)域互作從而幫助M1蛋白完成出芽。

3 討論

流感病毒作為一種人畜共患病病原，在國內(nèi)外都受到很高的重視，但是目前在H1N1流感病毒出芽機(jī)制方面的研究不多。M1蛋白作為流感病毒顆粒中含量最多的蛋白之一，它能夠與病毒基因組相互作用從而影響其出核過程，在病毒復(fù)制中扮演十分重要的角色，但是M1蛋白在H1N1流感病毒出芽過程中是否也具有重要作用尚不清楚。研究人員對M1蛋白的出芽能力存在爭議，有研究表明單獨M1蛋白可以獨立完成出芽，另外一些研究表明單獨的M1蛋白不具備出芽能力[7,9]。

圖4 截斷M1蛋白與M2蛋白共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞蛋白出芽情況Fig.4 Budding of truncated M1 proteins with M2 protein in 293T cells

本研究利用體外出芽實驗與BIFC方法驗證了單獨的M1蛋白在293T細(xì)胞中不能完成出芽，它可以通過與M2蛋白的互作，在M2蛋白的協(xié)助下完成出芽。本研究首次確定了M1蛋白的N端160個氨基酸是與M2發(fā)生相互作用的功能區(qū)域，M2蛋白通過與此功能區(qū)域互作從而協(xié)助M1蛋白出芽，而且M1蛋白的N端160氨基酸殘基是互作的最小功能區(qū)域，缺失N或者C端的20個氨基酸都會導(dǎo)致M1蛋白的N端結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，Western blot檢測不到蛋白。M1蛋白的N端1～160氨基酸殘基蛋白的晶體結(jié)構(gòu)圖也顯示1～20與140～160兩端氨基酸殘基正好構(gòu)成兩個B螺旋，在維持蛋白結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要作用[4]。另外，M1蛋白的1～20氨基酸與140～160氨基酸這兩個區(qū)域也有可能是與M2蛋白直接互作的功能區(qū)域，此推測尚需要進(jìn)一步研究證實。本研究首次揭示了M1蛋白與M2蛋白相互作用的功能區(qū)域，以及其在病毒出芽中的作用，為流感的相關(guān)研究與預(yù)防提供理論基礎(chǔ)，也為新型抗流感病毒藥物設(shè)計提供新的靶點與思路。

[1] Perdue M L, Garc?ˊA M, Senne D, et al.Virulence associated sequence duplication at the hemagglutinin cleavage site of avian influenza viruses[J]. Virus Res, 1997, 49(2)∶ 173-186.

[2] Sux T, Xue Y Z, Yan L, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLos Pathogens, 2013, 9(10)∶ 1078-1084.

[3] Lamb R A. Genes and proteins of the influenza viruses[M]//King R M. The Influenza Viruses, Springer US, 1989∶ 1-87.

[4] Harris A F, Forouhar S, Qiu B S, et al. The crystal structure of the influenza matrix protein M1 at neutral pH∶M1-M1 protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of M1[J]. Virology, 2001, 289∶ 34-44.

[5] Burleigh L M, Calder L J, Skehel J J, et al. Influenza a viruses with mutations in the m1 helix six domain display a wide variety of morphological phenotypes[J] J Virol, 2005,79∶1262-1270.

[6] Bui M, Wills E G,Helenius A, et al. Role of the influenza virus M1 protein in nuclear export of viral ribonucleoproteins[J]. J Virol, 2000,74(4)∶ 1781-1786.

[7] Wang D A, Harmon J, Jin D H, et al. The lack of an inherent membrane targeting signal is responsible for the failure of the matrix (M1) protein of influenza A virus to bud into virus-like particles[J]. J Virol, 2010, 84∶ 4673-4681.

[8] Chen B J, Leser G P, Jackson D, et al. The influenza virus M2 protein cytoplasmic tail interacts with the M1 protein and influences virus assembly at the site of virus budding[J]. J Virol, 2008, 82∶ 10059-10070.

[9] Rossman J S, Lamb R A. Influenza virus assembly and budding[J]. Virology, 2011, 411∶ 229-236.

[10] Pinto L H, Holsinger L J, Lamb R A. Influenza virus M2 protein has ion channel activity[J]. Cell, 1992, 69∶ 517-528.

[11] Schmidt N W, Abhijit M, Jun W, et al. Influenza virus A M2 protein generates negative Gaussian membrane curvature necessary for budding and scission[J]. J Ame Chem Soc, 2013, 135 (37)∶ 13710-13719.

[12] Sakaguchi T, Tu Q, Pinto L H, et al. The active oligomeric state of the minimalistic influenza virus M2 ion channel is a tetramer [J]. Proc Nat Acade Sci USA, 1997, 94∶ 5000-5005.

INTERACTION BETWEEN M1 AND M2 PROTEINS OF INFLUENZA VIRUS AND ITS ROLE IN VIRUS BUDDING

HOU Tian-long1,2, BAO Dan-qi3, LI Ze-jun2, LIU Qin-fang2, LIU Huan-qi1

(1. College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China; 3. Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China )

Inf uenza virus is an enveloped virus and released from infected cells by budding. M1 protein, a matrix protein of inf uenza virus, plays an important role in the pathogenicity of the virus and maintenance of the viral morphology. M2 protein, an ion channel protein, plays an important role in virus budding process. Previous studies have shown that M1 protein interacts with M2 protein but the function of this interaction in virus budding remains unclear and the interacting regions of M1 and M2 is unknown. M1 is divided into three regions, N terminal, C end and middle region according to its structure. In the present study, BiFC( biomolecular f uorescence complementation) and VLP(virus-like particle) experiments were conducted to investigate the interaction regions of M1 and M2 and functions of such interactions in virus budding. The results showed that M2 protein interacted with M1 protein through N terminal 1-160amino acids of M1 protein and M2 protein facilitated budding of M1 protein by interacting with this region of M1 protein. The regions consisting of 1-20 and 140-160 amino acids of M1 protein determined the stability and function of this protein. This study revealed the interacting regions between M1 protein and M2 protein and the function of this interaction in virus budding of inf uenza virus.

Inf uenza virus; M1 protein; M2 protein; budding

S852.659.5

A

1674-6422（2016）06-0001-05

2016-04-06

國家自然科學(xué)基金面上項目（31572543）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2016JB13)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才項目

侯天龍，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)；包旦奇，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉煥奇，E-mail：Huanqiliu@126.com；劉芹防，E-mail：liuqinfnag@shvri.ac.cn