劉東良，鐘登科，李蓓蓓，趙秋華，張克龍，石 坤，魏建超

（1.湖南省冷水江市畜牧水產(chǎn)局，冷水江 417500；2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.上海市閔行區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109）

·研究論文·

上海市豬源多殺性巴氏桿菌分離鑒定及其耐藥性分析

劉東良1，鐘登科2，李蓓蓓3，趙秋華4，張克龍3，石 坤3，魏建超3

（1.湖南省冷水江市畜牧水產(chǎn)局，冷水江 417500；2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.上海市閔行區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109）

本研究旨在調(diào)查上海市豬源多殺性巴氏桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥的耐藥情況，為該病的藥物預(yù)防與治療提供科學(xué)依據(jù)。2014～2015年在上海市11個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集疑似多殺性巴氏桿菌感染的病料共計(jì)116份，采用細(xì)菌分離培養(yǎng)及PCR方法，分離鑒定出20株多殺性巴氏桿菌。采用紙片法測(cè)定了分離菌株對(duì)20種臨床常用抗菌藥的敏感性，結(jié)果表明，所有菌株對(duì)阿莫西林克拉維酸、頭孢曲松、恩諾沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和多黏菌素B敏感，這6種藥物可作為本地區(qū)控制本病的首選藥物。然而，超過(guò)50%的菌株對(duì)青霉素（65.0%）、復(fù)方新諾明（65.0%）、氨芐西林（60.0%）、鏈霉素（60.0%）、四環(huán)素（60.0%）耐藥。耐藥譜分析顯示，85.0%的菌株對(duì)4～7種抗菌藥耐藥。本研究結(jié)果表明上海市豬源多殺性巴氏桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥較嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)豬多殺性巴氏桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)與防控。

多殺性巴氏桿菌；分離；耐藥；豬

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的一種革蘭陰性短小桿菌，也是一種重要的具有廣泛宿主范圍的病原菌，對(duì)多種動(dòng)物和人均有致病性，主要引起動(dòng)物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎。豬是多殺性巴氏桿菌的易感動(dòng)物之一，豬群中流行的多殺性巴氏桿菌血清型多為A型和D型，主要引發(fā)豬肺疫（porcine pasteurellosis）和豬萎縮性鼻炎（atrophic rhinitis，AR）[1]。

Pm廣泛分布于世界各地，正常存在于多種健康動(dòng)物的口腔和咽部黏膜。當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)、機(jī)體抵抗力低下時(shí)，Pm易大量繁殖，發(fā)生內(nèi)源性傳染[1-3]。近年來(lái)豬巴氏桿菌病在集約化豬場(chǎng)內(nèi)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，主要引起豬死亡、生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率降低等問(wèn)題，尤其是Pm與其他病毒和細(xì)菌的混合感染和繼發(fā)感染[4]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前豬巴氏桿菌病的控制主要依靠使用抗菌藥，但臨床上抗菌藥的盲目使用，使得Pm對(duì)其已產(chǎn)生不同程度的耐藥，這給該病的防控帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，上海市部分規(guī)模化豬場(chǎng)多殺性巴氏桿菌的感染呈逐年上升趨勢(shì)，為此，本研究對(duì)上海市11個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行豬多殺性巴氏桿菌的分離、PCR鑒定和耐藥性分析，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑 胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；革蘭氏染色液和瑞氏染色液均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌藥敏試紙購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，包括青霉素（penicillin，PEN）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林克拉維酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、頭孢噻呋（ceftiofur，CEF)、頭孢曲松(ceftriaxone，CRO)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENO)、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP)、復(fù)方新諾明（sulfamethoxazole，SMZ）、克林霉素（clindamycin，CLI）、氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)FC)、鏈霉素（streptomycin，STR）、慶大霉素（gentamicin，GEN）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、阿米卡星（amikacin，AMK）、紅霉素（erythromycin，ERY）、替米考星(tilmicosin，TIL)、阿奇霉素（azithromycin，AZM）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、強(qiáng)力霉素（doxycycline，DOX）和多黏菌素B（polymyxin B，PB）共20種臨床上常用的抗細(xì)菌藥物。

1.2 樣品來(lái)源 2014～2015年在上海市11個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，采集疑似多殺性巴氏桿菌感染的病死豬肺臟組織，共計(jì)116份。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采取的肺臟病變組織，劃線接種于含5%新生牛血清和10 mg/L NAD的TSA平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取可疑單菌落進(jìn)行傳代純化培養(yǎng)，取純培養(yǎng)的單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特點(diǎn)。

1.4 PCR鑒定 將上述初步鑒定后純化的細(xì)菌按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA為PCR模板，根據(jù)文獻(xiàn)[5]中方法進(jìn)一步做PCR鑒定，同時(shí)對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。針對(duì)Pm的Kmt1基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物（Pm-F和Pm-R）和16 S rDNA的通用引物（27 F和1492 R）見(jiàn)表1，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 藥敏試驗(yàn) 按照常規(guī)的紙片法操作對(duì)上述20株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)量各紙片的抑菌圈（mm）大小，參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，確定這些多殺性巴氏桿菌分離株的耐藥譜。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離培養(yǎng)與鏡檢 從采集的116份病料中分離到20株疑似多殺性巴氏桿菌的病原菌，分別編號(hào)為Pm-1～Pm-20，它們?cè)赥SA平板上長(zhǎng)成邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、直徑1～2 mm的露珠狀菌落。革蘭氏染色呈單個(gè)或成對(duì)陰性短桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染球桿菌，多數(shù)為單個(gè)存在。

表1 分離菌株P(guān)CR鑒定所用引物Table 1 PCR primers used for species identif cation of isolates

2.2 多殺性巴氏桿菌PCR鑒定與測(cè)序 應(yīng)用Pm特異性引物對(duì)20株分離菌株進(jìn)行PCR初步鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物均為457 bp的片段。同時(shí)對(duì)分離菌株16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，證實(shí)其序列與Pm 16S rDNA序列相符，部分菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。本研究共采集檢測(cè)了116個(gè)樣品，最終分離鑒定到20株P(guān)m，分離率為17.24%。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig. 1 PCR identif cation result of clinical isolates

2.3 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

2.3.1 抗菌藥物敏感性 20株P(guān)m對(duì)20種抗菌藥的敏感性檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表2，所有菌株對(duì)阿莫西林克拉維酸、頭孢曲松、恩諾沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和多黏菌素B敏感，這6種藥物可作為上海市控制本病的首選藥物。參照NCCLS提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定上述藥物的耐藥率大小順序：青霉素、復(fù)方新諾明＞氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素＞強(qiáng)力霉素、克林霉素＞卡那霉素＞慶大霉素＞紅霉素＞替米考星＞阿米卡星＞頭孢噻呋、環(huán)丙沙星。總體而言，本研究中Pm對(duì)青霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥率相對(duì)較高，對(duì)林可酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)也存在一定程度的耐藥。

2.3.2 多重耐藥性與耐藥譜 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)分離菌株多重耐藥性進(jìn)行分析，本研究中Pm的主要耐藥譜型有14種，耐4種藥物的菌株數(shù)最多，85%的菌株對(duì)4～7種的抗菌藥耐受，最多同時(shí)耐9種藥物，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

3 討論

豬多殺性巴氏桿菌是豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（porcine respiratory disease complex, PRDC）的重要致病原之一，在豬群中屬于條件致病菌，即該菌是豬群的常在菌，在豬抵抗力低下時(shí)可侵入機(jī)體而發(fā)生內(nèi)源性感染。Pm還可與多種病原混合協(xié)同感染，從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和死亡率，造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究于2014～2015年從上海市11個(gè)疑似感染多殺性巴氏桿菌的規(guī)模化豬場(chǎng)，隨機(jī)采集116份疑似病料，通過(guò)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、PCR鑒定和16S rDNA序列測(cè)定，共分離20株豬多殺

性巴氏桿菌，分離率為17.24%。結(jié)果說(shuō)明豬多殺性巴氏桿菌感染在上海市比較普遍，流行情況較為嚴(yán)重，已對(duì)該地養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成潛在威脅，成為養(yǎng)豬業(yè)的重要呼吸道疾病之一，因此應(yīng)引起各養(yǎng)豬場(chǎng)和動(dòng)物防疫部門(mén)的高度重視。

表2 20株豬源多殺性巴氏桿菌分離株對(duì)20種藥物的敏感性Table 2 The sensitivity of the P. multocida isolates to 20 antibacterial agents in this study

表3 20株豬源多殺性巴氏桿菌分離株的耐藥譜Table 3 Drug resistance spectrum of the P. multocida isolates

表4 20株豬源多殺性巴氏桿菌分離株的多重耐藥性Table 4 Multiple resistance of the P. multocida isolate

目前豬多殺性巴氏桿菌病的控制主要依靠使用抗生素，但在實(shí)際生產(chǎn)中長(zhǎng)期盲目地誤用、濫用抗生素，使得細(xì)菌耐藥情況愈加突出，給該病的防治造成一定的困難。2000年以來(lái)，我國(guó)豬場(chǎng)發(fā)生疑似多殺性巴氏桿菌感染的報(bào)道陸續(xù)增多，特別是近幾年急驟上升。廖素環(huán)等[7]對(duì)2009～2010年廣西省5個(gè)地區(qū)分離的14株P(guān)m進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株對(duì)磺胺類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)和林可胺類(lèi)抗菌藥的耐藥率比較高，均在79%以上。桂文龍等[8]對(duì)2011～2012年蘇中地區(qū)分離的21株豬進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)這些分離菌株對(duì)頭孢氨芐、復(fù)方新諾明、紅霉素、鏈霉素、青霉素G、四環(huán)素和林可霉素7種抗菌藥物耐藥較嚴(yán)重，耐藥率在85%以上。本次調(diào)查中20株P(guān)m對(duì)14種抗菌藥物存在不同程度的耐藥，上海市分離的20株P(guān)m對(duì)青霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥率相對(duì)較高，對(duì)林可酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)也存在一定程度的耐藥，而且均存在多重耐藥現(xiàn)象。其中對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、克林霉素的耐藥率均在50%以上。因此，建議在實(shí)際生產(chǎn)中，采用細(xì)菌體外分離培養(yǎng)與鑒定確診病原后，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果有針對(duì)性的用藥，避免盲目濫用、長(zhǎng)期使用同種抗菌藥物。同時(shí)可對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行定期細(xì)菌藥敏監(jiān)測(cè)，為臨床用藥提供數(shù)據(jù)支撐與指導(dǎo)。

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ISOLATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF PORCINE PASTEURELLA MULTOCIDA STRAINS IN SHANGHAI

LIU Dong-liang1, ZHONG Deng-ke2, LI Bei-bei3, ZHAO Qiu-hua4, ZHANG Ke-long3, SHI Kun3, WEI Jian-chao3

(1. Bureau of Animal Husbandry and Fisheries in Lengshuijiang City of Hunan Province, Lengshuijiang 417500, China; 2. Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Shanghai 201600, China; 3. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 4. Minhang Center of Animal Disease Prevention and Control in Shanghai, Shanghai 201109, China)

The aim of this study was to investigate antibiotic resistance in porcine Pasteurella multocida isolates in Shanghai and to provide information for drug use in clinical treatment. Total 20 P. multocida strains were isolated from 116 swine samples in 2014-2015. All isolates were susceptible to amoxicillin-clavulanic acid, ceftriaxone, enrof oxacin, f orfenicol, azithromycin and polymyxin B. Some isolates were resistant to penicillin(65.0%), sulfamethoxazole(65.0%), ampicillin(60.0%), streptomycin(60.0%) and tetracycline（60.0%）. Total 17 strains were resistant to all of 4-7 antibiotics. The results of this study suggested that antibiotic resistance in porcine P. multocida isolates in Shanghai was prevailing. Therefore, it was necessary for monitoring and prevention of P. multocid infection in pigs.

Pasteurella multocida; isolation; antibiotic resistance; swine

S852.612

A

1674-6422（2016）06-0019-05

2016-06-28

上海市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目 (滬農(nóng)科產(chǎn)字2015第6號(hào))；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2013）第5-6號(hào)）

劉東良，男，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物細(xì)菌疫病研究

魏建超，E-mail：jianchaowei@shvri.ac.cn