童 武，李國(guó)新，鄭 浩，劉 飛，梁 超，李 林，田 青，曹艷云，武吉強(qiáng)，王 濤，鄭旭晨，單同領(lǐng)，童光志

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的制備及免疫效力評(píng)價(jià)

童 武1,2，李國(guó)新1,2，鄭 浩1,2，劉 飛1，梁 超1，李 林1，田 青1，曹艷云1，武吉強(qiáng)1，王 濤1，鄭旭晨1，單同領(lǐng)1,2，童光志1,2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

本研究將豬偽狂犬病毒雙基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）用0.15%的甲醛滅活后，與賽彼科公司 MONTANIDE ISA 201VG 佐劑進(jìn)行乳化，制備成豬偽狂犬病滅活疫苗。為了評(píng)價(jià)滅活疫苗的免疫效力，15頭14日齡的健康仔豬（豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原和抗體均為陰性）隨機(jī)分成3組，每組5頭。第一組豬頸部肌肉接種豬偽狂犬病滅活疫苗 （JS-2012-△gI/gE株）每頭2 mL，接種后28 d，第一組和第二組同樣方式同等劑量接種豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株），第三組豬作為對(duì)照。第二次免疫后d 28，三組實(shí)驗(yàn)豬均滴鼻接種PRV JS-2012第5代強(qiáng)毒，每頭105.0TCID50/2 mL。攻毒后0～14 d，每日測(cè)量體溫并記錄臨床癥狀。通過抗體檢測(cè)和保護(hù)效率來評(píng)價(jià)豬偽狂犬病滅活疫苗 （JS-2012-△gI/gE株）免疫效力。結(jié)果表明，兩次免疫（第一組）PRV gB 抗體水平明顯高于一次免疫（第二組），兩次免疫提供了更好的保護(hù)效力。

偽狂犬病毒；滅活疫苗；制備；效力評(píng)價(jià)

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的高死亡率的急性傳染病，該病以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征[1]。PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬，其基因組為線狀雙鏈DNA，長(zhǎng)約150 kb，由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)（unique long region，UL）、短獨(dú)特區(qū)（unique short region，US）及US兩側(cè)的內(nèi)部重復(fù)序列與末端重復(fù)序列組成，編碼70多種蛋白[2-5]。PRV能感染多種宿主，但豬是其主要的天然宿主、貯存者和傳播者。不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，及種豬不育[1,6,7]。我國(guó)于20世紀(jì)40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)PRV，60年代初在豬群中也出現(xiàn)了PRV流行，至今該病毒仍在我國(guó)豬群中廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)豬群的健康[8]，并造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[9]。對(duì)豬偽狂犬病的防控與凈化最有效的手段是接種基因缺失疫苗并配合血清學(xué)檢測(cè)來完成[10,11]。自20世紀(jì)90年代我國(guó)使用偽狂犬病活疫苗Bartha k61株對(duì)豬偽狂犬病進(jìn)行防控，使其得到了有效的控制。2011年，由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)大面積爆發(fā)，造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。童武等[7]研究表明，該變異株病毒與經(jīng)典的偽狂犬病毒強(qiáng)毒株相比，其許多基因發(fā)生了較大的變異；且該變異株病毒對(duì)小鼠和豬的致病力較經(jīng)典的偽狂犬病毒強(qiáng)毒株也明顯增強(qiáng)；同時(shí)免疫保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，Bartha k61疫苗已經(jīng)不能有效的為免疫豬群提供保護(hù)[12-17]。目前豬偽狂犬病毒變異株已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)流行，疫病防控形勢(shì)嚴(yán)峻，國(guó)內(nèi)很多研究學(xué)者都在研制針對(duì)偽狂犬病毒變異株的疫苗[18-23]。本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用同源重組的方法成功構(gòu)建出了偽狂犬病疫苗候選株JS-2012-△gI/gE，以JS-2012-△gI/gE毒株為種毒研制豬偽狂犬病滅活疫苗[24]，現(xiàn)將豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的制備方法及其免疫效力研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 種毒、細(xì)胞、佐劑 偽狂犬病毒雙基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病研究室構(gòu)建[24]，制苗用偽狂犬病毒液（JS-2012-△gI/gE株，107.0TCID50/mL）和Vero細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病研究室（本研究室）制備并保存；佐劑MONTANIDE ISA 201VG購(gòu)于賽彼克（上海）特殊化學(xué)品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)豬、實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 本實(shí)驗(yàn)所使用的陰性實(shí)驗(yàn)豬購(gòu)自南京某豬場(chǎng)；偽狂犬病毒gB和gE抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用的注射器、采血器、防護(hù)服、體溫計(jì)等均購(gòu)自上?；羯锟萍加邢薰?；胎牛血清、胰酶和DMEN為Invitrogen公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自上海百賽生物科技有限公司。

1.3 病毒的滅活 將制苗用病毒液分為2組，每組分別加入終濃度為0.15%或0.2%的甲醛溶液，37℃滅活，滅活期間每隔4～6 h搖勻病毒液1次。在滅活后24 h和36 h每組各取出一部分病毒液，用于滅活檢驗(yàn)。

1.4 滅活檢驗(yàn) 取滅活后的病毒液，用含2%小牛血清的DMEM做50倍稀釋，然后按合適的體積比用含2%小牛血清的DMEM細(xì)胞維持液稀釋后，接種T150細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的長(zhǎng)成良好單層Vero細(xì)胞的T150細(xì)胞培養(yǎng)瓶（用前棄去培養(yǎng)液），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，凍融1次，取上清液，按合適的體積比用含2%小牛血清的DMEM細(xì)胞維持液稀釋后，按上述方法再盲傳2次，觀察并記錄細(xì)胞病變。如無細(xì)胞病變，則病毒滅活完全。

1.5 滅活疫苗制備 先將疫苗佐劑（賽彼科公司201水包油包水佐劑）輸入乳化罐中低速（80 r/min）攪拌，按照質(zhì)量比再緩慢加入經(jīng)無菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)合格的病毒液。當(dāng)溫度達(dá)到31℃時(shí)，加速（330 r/ min）乳化40 min，然后把轉(zhuǎn)速慢慢降到150 r/min，再把溫度降到20℃以下，分裝。取一部分用于性狀檢驗(yàn)，其余保存于2℃～8℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫效力試驗(yàn) 將15頭14日齡豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原、抗體陰性的健康仔豬隨機(jī)分成5組，每組3頭。第一組豬接種豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）2 mL/頭，免疫后28 d第一組和第二組豬接種豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）2 mL/頭，第三組實(shí)驗(yàn)豬不做處理作為對(duì)照。待第二次免疫后28 d，3組實(shí)驗(yàn)豬均滴鼻接種PRV JS-2012第5代強(qiáng)毒2 mL，含105.0TCID50/頭，并觀察臨床表現(xiàn)（體溫、呼吸癥狀、食欲、生長(zhǎng)狀態(tài)和神經(jīng)癥狀等）。分別在免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56 d，以及攻毒后1～14 d采集血液并分離血清。攻毒后14 d剖殺剩余實(shí)驗(yàn)豬，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.7 PRV抗體檢測(cè) 將攻毒前不同時(shí)間點(diǎn)采集的豬血清，用IDEXX公司 PRV gB和gE抗體檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)針對(duì)PRV的特異性gB和gE抗體。

1.8 臨床及組織病理變化觀察 對(duì)攻毒試驗(yàn)中發(fā)病死亡或試驗(yàn)結(jié)束迫殺的仔豬，進(jìn)行病理剖檢。取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織進(jìn)行眼觀病變觀察并拍照。對(duì)上述所取的各組豬的組織臟器用10%中性福爾馬林固定，制作病理切片，在顯微鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 制苗用病毒液的滅活效果 對(duì)收獲的病毒液（JS-2012-△gI/gE）株進(jìn)行滅活，滅活效果顯示，在收獲的病毒液中加入終濃度為0.15%和0.2%的甲醛，作用24 h和36 h，都能使病毒完全滅活，病毒液在Vero細(xì)胞上盲傳3代均未出現(xiàn)細(xì)胞病變。

2.2 滅活疫苗的制備及檢驗(yàn) 將滅活后的病毒液與佐劑MONTANIDE ISA 201VG進(jìn)行乳化。性狀檢驗(yàn)：外觀，乳化好的滅活疫苗為均勻的淡粉紅色乳劑，符合規(guī)定要求；劑型，取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于清潔冷水表面，呈云霧狀擴(kuò)散，符合規(guī)定要求；粘度，用旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)檢測(cè)，為81 cP，符合規(guī)定要求；穩(wěn)定性，吸取疫苗10 mL加入離心管中，以1811×g離心15 min，無析出，符合規(guī)定要求。無菌檢驗(yàn)，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，無菌生長(zhǎng)。

2.3 臨床癥狀 各疫苗免疫組的實(shí)驗(yàn)豬在接種疫苗后均無過敏反應(yīng)，接種部位無炎性反應(yīng)。疫苗接種后除個(gè)別仔豬出現(xiàn)短暫的厭食外，其余試驗(yàn)豬均無異常表現(xiàn)。攻毒后，第一組（免疫2次）實(shí)驗(yàn)豬有短暫的發(fā)熱，無任何其他異常臨床表現(xiàn)，保護(hù)率為100%；第二組（免疫1次），有2頭豬d3開始發(fā)病，表現(xiàn)精神沉郁、厭食和身體持續(xù)性顫栗，其余3頭實(shí)驗(yàn)豬有發(fā)熱，但無任何其他異常臨床表現(xiàn)，保護(hù)率為60%；第三組，在攻毒后48 h，5頭實(shí)驗(yàn)豬體溫均迅速上升到41℃以上，并表現(xiàn)為明顯的精神沉郁、厭食、呼吸困難和神經(jīng)癥狀，并在攻毒后的d6死亡2頭仔豬，d7死亡1頭仔豬，發(fā)病率為100%，死亡率為60%。詳見表1、圖1和圖2。

表1 豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的免疫效果Table 1 Protective eff cacy of inactivated swine Pseudorabies vaccines (JS-2012-△gI/gE strain)

2.4 PRV的特異性抗體檢測(cè) 第一組在攻毒前gB抗體均呈強(qiáng)陽性，S/N值均在0.05左右且離散度小；第二組在攻毒前gB抗體雖均呈陽性，但S/N值均在0.12與 0.42之間且離散度大；第三組在對(duì)應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)PRV gB抗體均為陰性。各組全部試驗(yàn)豬PRV gE抗體在攻毒前的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為陰性（圖3）。

圖1 攻毒后豬的體溫變化Fig.1 Body temperature changes of piglets at 0-14 days post challenged with PRV JS-2012

圖2 攻毒后各組豬不同時(shí)間的存活情況Fig.2 Survival of piglets at 0-14 days post challenged with PRV JS-2012

圖3 免疫豬PRV特異性抗體動(dòng)態(tài)變化Fig. 3 PRV specif c antibody responses in piglets of different groups after immunization

2.5 臨床眼觀病理變化 對(duì)本實(shí)驗(yàn)中攻毒后死亡或?qū)嶒?yàn)結(jié)束迫殺的仔豬進(jìn)行解剖。取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織進(jìn)行眼觀病變觀察并拍照。第一組所有實(shí)驗(yàn)豬的腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織臟器均未見明顯眼觀病理變化。第二組，2頭發(fā)病的豬腦脊液明顯增多，腦膜腫脹增厚，血管擴(kuò)張，并伴隨少量出血；肺臟輕度氣腫，并伴有出血、壞死、肉實(shí)變；腹股溝淋巴結(jié)輕微充血腫脹；脾臟邊緣輕微淤血且腫大；腎臟可見少量點(diǎn)狀出血；肝臟邊緣淤血壞死。第三組，病死或最終存活的仔豬大都體型消瘦且被毛粗亂，剖檢見腦脊液明顯增多，腦膜腫脹且明顯增厚、血管擴(kuò)張，并伴隨嚴(yán)重出血；肺臟氣腫，并伴有出血，壞死，大面積肉實(shí)變；腹股溝淋巴結(jié)明顯充血腫脹；脾臟邊緣明顯淤血且腫大；腎臟可見大量點(diǎn)狀出血；肝臟邊緣嚴(yán)重淤血壞死（圖4）。

2.6 組織病理學(xué)觀察 對(duì)攻毒后死亡或?qū)嶒?yàn)結(jié)束迫殺的仔豬進(jìn)行解剖。每頭豬取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)組織，用10% 中性福爾馬林固定，選取腦、肺臟、肝臟進(jìn)行病理切片制作。病理切片顯示，第一組實(shí)驗(yàn)豬腦、肺臟、肝臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、心臟等組織均未見明顯病理變化。第二組發(fā)病豬腦膜表面血管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肺臟組織未見明顯病理變化；肝細(xì)胞空泡樣變性；腎臟多發(fā)性腎組織壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、心臟均未見明顯病理變化。第三組實(shí)驗(yàn)豬腦珠網(wǎng)膜下血管高度擴(kuò)張充血、出血，膿性滲出，大腦皮層腦水腫，充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肺臟淤血水腫；肝臟淤血；腎臟腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；腹股溝淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞減少；脾臟淋巴細(xì)胞減少，脾臟萎縮；心臟未見明顯病理變化（圖5）。

圖4 免疫后攻毒豬剖解的眼觀病變F i g . 4 T h e a u t o p s y l e s i o n s o f p i g l e t s a f t e r i m m u n i z a t i o n a g a i n s t p o i s o n

圖5 攻毒組及空白對(duì)照組不同組織的病理切片觀察（H E , 2 0 0 ×）F i g . 5 P a t h o l o g i c a l s e c t i o n o b s e r v a t i o n o f d i f f e r e n t t i s s u e s i n p i g s a f t e r c h a l l e n g e（H E , 2 0 0 ×）

3 討論

2011年以來，由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)大面積爆發(fā)，造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株的侵襲，傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能提供完全的保護(hù)。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異株運(yùn)用同源重組的方法成功構(gòu)建出了偽狂犬病疫苗候選株JS-2012-△gI/gE，并以JS-2012-△gI/gE毒株為種毒研制了豬偽狂犬病滅活。本研究主要是探討豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗的制備及其免疫效力評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，第一組免疫后能產(chǎn)生高水平的gB抗體，攻毒后試驗(yàn)豬除了短暫發(fā)熱外，未見其他臨床癥狀，且剖解眼觀病變與組織病理切片顯示也均良好。第二組免疫后能產(chǎn)生gB抗體但抗體滴度及整齊度均不佳，攻毒后有兩頭實(shí)驗(yàn)豬發(fā)病，剖解眼觀病變與組織病理切片顯示發(fā)病豬的組織臟器也均有病理變化。第三組攻毒后實(shí)驗(yàn)豬全部發(fā)病，死亡率60%，剖解眼觀病變與組織病理切片顯示發(fā)病豬及死亡豬的組織臟器也均有嚴(yán)重病理損傷。根據(jù)本研究結(jié)果，我們確定豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）的免疫次數(shù)為2次，免疫間隔28 d。

豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗具備常規(guī)滅活疫苗的安全性，不會(huì)存在散毒及毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，且該滅活疫苗具有很好的免疫原性，同時(shí)該滅活疫苗缺失的gE基因能夠作為分子標(biāo)記來區(qū)分疫苗接種動(dòng)物與野毒感染動(dòng)物。本研究將為偽狂犬病毒變異株的防控及凈化提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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PREPARATION AND IMMUNE EFFICACY EVALUATION OF INACTIVATED SWINE PSEUDORABIES VACCINE (JS-2012-△gI/gE STRAIN)

TONG Wu1,2, LI Guo-xin1,2, ZHENG Hao1,2, LIU Fei1, LIANG Chao1, LI Lin1, TIAN Qing1, CAO Yanyun1, WU Ji-qiang1, WANG Tao1, ZHENG Xu-chen1, SHAN Tong-ling1,2, TONG Guang-zhi1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The Pseudorabies virus (PRV, JS-2012-△gI/gE strain) inactivated with 0.15% formalin was homogenized with MONTANIDE ISA 201 VG (SEPPIC) to prepare the inactivated swine PR vaccine. In order to evaluate the protective effcacy of the inactivated swine PR vaccine, fifteen 2-week-old piglets which were free of PRV, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), porcine circovirus (PCV2) and classical swine fever virus (CSFV)) were selected randomly and divided equally into three groups. Group 1 were inoculated intramuscularly (i.m.) with 2 mL of inactivated swine Pseudorabies vaccines (JS-2012-△gI/gE strain). At 28 dayspost-frst inoculation, group 1 and group 2 were inoculated intramuscularly. with the inactivated vaccines at the same dosage. group 3served as uninoculated control. At 28 days post-inoculation (DPI), all piglets were challenged intranasally with 105.0TCID50of PRV (JS-2012 strain). Following the challenge, clinical signs and rectal temperatures were recorded daily for 14 days. The results showed PRV g B antibody levels of piglets vaccinated twice (Group 1) was higher than those vaccinated once (Group 2), The protective eff cacy of the inactivated swine PR vaccine against PRV after double inoculation(Group 1) was better than that after single inoculation (Group 2).

Pseudorablies virus; inactivated vaccine; preparation; immune eff cacy evaluation

S852.659.1

A

1674-6422（2016）06-0012-07

2016-04-21

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14ZR1448900)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號(hào)）；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203039）

童武，男，碩士，助理研究員，主要從事豬偽狂犬病毒及其疫苗的研究

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn