徐帥兵，黃 兵,3，趙其平，董 輝，朱順海，崔曉霞，謝雨翔，唐 敏,2，楊志遠,2，韓紅玉

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2. 上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的構建

徐帥兵1，黃 兵1,3，趙其平1，董 輝1，朱順海1，崔曉霞1，謝雨翔1，唐 敏1,2，楊志遠1,2，韓紅玉1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2. 上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

為了篩選柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵相關的蛋白，利用酵母雙雜交體系構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫。提取純化的子孢子總RNA，經(jīng)MMLV-RT反轉錄合成cDNA第一鏈后，利用LD-PCR擴增合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，dscDNA經(jīng)純化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns 純化剔除小于200 bp的片段。將純化后dscDNA、pGADT7-Rec及CarrierDNA共轉化到已經(jīng)制備好的酵母感受態(tài)細胞Y187中，dscDNA與pGADT7-Rec以同源重組的方式在細胞內(nèi)進行連接，經(jīng)過缺陷性培養(yǎng)基（SD/-Leu）的篩選得到酵母雙雜交cDNA文庫。結果顯示，構建的柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的轉化率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫滴度為3.62×107cfu/mL。隨機挑取32個單克隆進行PCR檢測，插入片段大小為200～2000 bp，重組率為93.75%，并以該文庫作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲5對特異性引物進行PCR擴增，獲得了這5個基因片段。結果表明成功構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，為進一步篩選和研究球蟲入侵互作蛋白奠定了基礎。

柔嫩艾美耳球蟲；子孢子；酵母雙雜交cDNA文庫；同源重組

雞球蟲病是由幾種艾美耳球蟲（Eimeria）寄生于雞腸道并在繁殖過程中嚴重損害腸道組織細胞而引起的一種全球性寄生蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。集約化養(yǎng)雞場尤其為雞球蟲的生存和傳播提供了更多的便利條件[1]。據(jù)報道在我國雞群中流行的雞球蟲有9種[2]，其中柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）和毒害艾美耳球蟲（E. necatrix）毒力較強，危害較大，常引起雞死亡。柔嫩艾美耳球蟲作為頂復器門原蟲的成員之一，屬于專性細胞內(nèi)寄生蟲，它們有共同的入侵機制。這類寄生蟲入侵宿主細胞的過程十分復雜，目前已知是由3種細胞器（微線體、棒狀體、致密顆粒）分泌的一系列蛋白的相互作用來完成[3]，但是這些相互作用蛋白之間的聯(lián)系以及蛋白的分泌是由什么信號介導的，至今尚不清楚。所以，研究這些蛋白之間的相互作用機制，可以為尋找新的藥物靶標及控制球蟲入侵提供有效途徑。

由Fields等[4,5]建立的酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白互作的經(jīng)典方法，現(xiàn)在已被廣泛用于互作蛋白的篩選與鑒定，不僅可以尋找蛋白發(fā)揮作用的關鍵結構域[6]，還能建立蛋白質互作圖譜[7]等。傳統(tǒng)的研究蛋白互作的方法，如Pull-down、Co-IP、免疫共沉淀等，僅能篩選到少量蛋白。酵母雙雜交是模擬體內(nèi)環(huán)境在核酸水平上進行，不受環(huán)境和試驗條件的限制，可以用某個關鍵的蛋白作為誘餌，對酵母雙雜交cDNA文庫進行大規(guī)模的蛋白篩選，在短時間內(nèi)即可獲得大量的互作蛋白，進而研究蛋白互作的意義及其功能[8]。

國內(nèi)外很多學者為了研究已知蛋白的功能和作用位點，構建了不同的酵母雙雜交cDNA文庫。Mahajan等[9]構建了來自豬腎細胞LFBK細胞系的酵母雙雜交cDNA文庫。Xue等[10]構建了柔嫩艾美球蟲第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫。程子英等[11]構建了弓形蟲RH株酵母雙雜交cDNA文庫。由于在球蟲的整個生活史中，子孢子是球蟲入侵雞腸道組織細胞的第一階段，在整個入侵過程中發(fā)揮著至關重要的作用。因此，本研究成功利用酵母雙雜交方法構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母cDNA文庫，為進一步篩選子孢子階段入侵相關的蛋白及功能基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trizol試劑盒購于TaKaRa公司；Make Your Own“Mate & PlateTM”Library System User Manual、YPD Medium、YPD Agar Medium、Minimal SD Agar Base、-Leu DO Supplement、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2均購自Clontech公司。

1.2 引物設計 根據(jù)實驗室前期的相關研究，用Primer Primier 5.0軟件設計了5個柔嫩艾美耳球蟲基因的特異性引物，引物由上海賽百盛公司合成。

表1 本研究所用引物Table1 Primers used in this study

1.3 柔嫩艾美耳球蟲子孢子的收集與純化 柔嫩艾美耳球蟲上海株保存于中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物原蟲病創(chuàng)新團隊。首先將5×104個孢子化卵囊/只接種于2周齡無球蟲感染的三黃雞，感染后收集d 6～8糞便中的卵囊，27℃條件下在2.5%重鉻酸鉀溶液中28℃進行孢子化，至孢子化率達到80%以上，收集卵囊。然后用飽和食鹽水漂浮法對孢子化卵囊進行漂浮純化，收集絮狀物，10倍稀釋后離心棄上清，沉淀用2倍體積的次氯酸鈉懸浮，氧化30 min。按1∶1比例加入蒸餾水稀釋，使次氯酸鈉含量約為50%，轉移至50 mL離心管中離心，收集白色絮狀物即為孢子化卵囊。收集的孢子化卵囊經(jīng)玻璃珠震蕩破碎其細胞壁，用滅菌HBBS洗滌以去除部分卵囊壁碎片，然后離心收集孢子囊，經(jīng)6%雞膽汁和0.5%胰蛋白酶37℃消化至90%子孢子自孢子囊中溢出。離心，HBBS洗滌2次去除絕大部分孢子囊碎片，沉淀用HBBS懸浮，然后經(jīng)G4砂芯漏斗過濾，收取濾液，離心棄上清，獲得的沉淀即為柔嫩艾美耳球蟲子孢子，保存于液氮中備用。

1.4 總RNA的提取 按照子孢子50～100 mg/mL RNAiso Plus比例懸浮子孢子，充分混勻，室溫靜置5 min。根據(jù)Trizol試劑盒的說明書進行操作，最后將得到的總RNA溶解于20μL DEPC水中，紫外分光光度計測定總RNA純度及濃度，用瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.5 第一鏈的合成 按照Make Your Own“Mate & PlateTM”Library System User Manual說明書步驟，取2 μL總RNA、1.0 μL CDS Ⅲ、1.0 μL ddH2O于無RNase離心管中，離心混勻，72℃孵育2 min，冰上冷卻2 min，向離心管中依次加入2.0 μL 5×firststrand buffer、1.0 μL dNTP Mix、1.0 μL DTT、1.0 μL SMART MMLV reverse transcriptase，手指輕彈，離心混勻，42℃孵育10 min。接著加入1 μL SMERT Ⅲ-modified oligo混勻，42℃孵育1 h后，再以75℃孵育10 min終止反應。最后室溫冷卻，加入1 μL RNase H，37℃孵育20 min，快速離心，使液體聚集管底，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 雙鏈的合成及純化 將PCR儀預熱至95℃，在PCR管中依次加入2 μL first-strant cDNA、10 μL 10×advantage 2 PCR buffer、2 μL 50×dNTP Mix、上下游PCR 引物各2 μL、10 μL 10×melting solution、2 μL 50×advantage 2 polymerase mix、70 μL deionized H2O，總體積為100 μL，離心混勻，分裝2管，放到預熱的PCR儀中。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，68℃退火延伸6 min，21個循環(huán)；68℃延伸5 min。取4 μL PCR產(chǎn)物保存?zhèn)溆?。取出Chroma Spin TE-400柱子，上下顛倒使柱內(nèi)基質懸浮，去掉上下端蓋子，置于1個2 mL收集管中，室溫605×g，離心5 min，將柱子置于一個新的收集管中。將上述剩余的PCR產(chǎn)物加入柱中間基質上，室溫605×g離心5 min，保留收集管。向收集管中加入預冷的1/10體積的NaAc、2.5倍體積的95%乙醇，上下顛倒使之混勻，-20℃冰箱內(nèi)放置1 h。室溫20598×g離心20 min，小心吸去上清，室溫干燥10 min，最后用20 μL ddH2O懸浮沉淀并混勻。dscDNA純化前后各取4 μL進行凝膠電泳，檢驗純化效果，其余-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 酵母感受態(tài)的制備 在YPDA固體培養(yǎng)基上用三區(qū)劃線法對Y187酵母菌劃板，30℃培養(yǎng)3～4 d。挑取4個直徑2～4 mm的酵母菌于離心管中，30℃、245 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)11 h，測定其OD600值，選取生長速度最快的繼續(xù)培養(yǎng)。取酵母菌液5 μL于500 mL錐形瓶中（含有50 mL YPDA液體培養(yǎng)基），30℃、245 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)18～20 h，直至OD600值達到0.15～0.3，946×g離心 5 min，去上清。再用100 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸酵母細胞，30℃、245 r/min震蕩培養(yǎng)3～5 h，離心去上清，用無菌ddH2O重懸沉淀，再離心去上清。用TE/LiAc重懸酵母細胞，瞬時離心15 s，去上清，再用TE/LiAc重懸酵母細胞，置于冰上。

1.8 cDNA文庫的構建 根據(jù)說明書制備好Y187酵母感受態(tài)細胞，然后將Carrier DNA、dsDNA、pGADT7-Rec質粒共轉化到Y187酵母感受態(tài)細胞中，轉化產(chǎn)物用0.9% NaCl重懸后均勻涂布于SD/-Leu缺陷性培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。平板上有大量的酵母長出時，開始收集文庫。先將平板在4℃冰箱中預冷3～4 h，向每個平板上滴加4℃預冷的含25%甘油的YPDA液體培養(yǎng)基4 mL，用無菌細胞刮將酵母從培養(yǎng)基上刮下來，收集至錐形瓶中混勻。檢測轉化子密度大于2×107cfu/mL，若小于該密度，可通過離心濃縮，然后分裝于50 mL和1 mL離心管中，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 文庫質量的鑒定

1.9.1 轉化效率的檢測 篩選轉化子時，取100 μL轉化混合物按1∶10、1∶102、1∶103稀釋。每個稀釋度取50 μL涂布于100 mm的SD/-Leu缺陷性培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計生長出的菌落數(shù)量，計算轉化效率（轉化率=N×稀釋倍數(shù)×轉化混合物總體積/鋪板體積）。

1.9.2 文庫容量檢測 文庫菌液按1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋，每個稀釋度取50 μL涂布于100 mm的SD/-Leu缺陷性培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計生長出的菌落數(shù)量，再計算文庫滴度（文庫滴度=N×稀釋倍數(shù)/鋪板體積）。

1.9.3 插入片段大小檢測 用牙簽從文庫滴度檢測的SD/-Leu平板上分別挑取32個單克隆，溶于50 μL ddH2O中，再用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2進行PCR鑒定。反應體系：PCR Mix 45μL、模板5μL。PCR程序：94℃預變性1 min；98℃變性10 s，68℃退火延伸3 min，30個循環(huán)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析文庫插入片段的大小以及重組率。

1.9.4 用柔嫩艾美耳球蟲特異性引物從文庫中釣取基因 取1 mL cDNA文庫，于液氮和沸水中反復凍融5次，破壞酵母細胞壁，3783×g離心5 min，取上清作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲的特異性引物進行PCR擴增。反應體系：模板3 μL、上下游引物各1 μL、2×PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL。PCR程序：95℃預變性2 min；95℃變性40 s, 50℃～60℃退火40 s（根據(jù)各個引物Tm值有所改變），72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min；4℃結束。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將與原序列大小相近的單一條帶切下，膠回收PCR產(chǎn)物，并與pGEMT-easy Vector連接過夜，轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10中，37℃培養(yǎng)10～12 h。挑取單克隆搖菌，取1 mL送去測序，并將測序結果與原序列進行Blast比對。

2 結果

2.1 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊及子孢子的純化 用純種柔嫩艾美耳球蟲接種2周齡無球蟲雞，收集感染后6～8 d的卵囊，在2.5%重鉻酸鉀溶液中于 28℃培養(yǎng)后獲得孢子化卵囊，經(jīng)飽和食鹽水漂浮和次氯酸鈉純化后獲得純化的孢子化卵囊（圖1A）。孢子化卵囊經(jīng)玻璃珠破碎后，經(jīng)胰酶和膽汁消化，子孢子從孢子囊逸出，再經(jīng)G4漏斗過濾純化后獲得純化的子孢子（圖1B）。

圖1 孢子化卵囊(A)和子孢子(B)的純化Fig.1 Purif cation of the sporulated oocysts(A) and sporozoite(B)

2.2 子孢子總RNA的提取 提取子孢子總RNA后，經(jīng)紫外分光光度計測定總RNA濃度為1077.7 ng/μL，OD260/OD280為1.98。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可以看到3條較亮的條帶，分別是28S、18S和5S（圖2）。結果說明提取的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA的純度和質量較高，可用于后續(xù)子孢子酵母cDNA文庫的構建。

圖2 子孢子總RNA電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of total RNA from sporozoite

2.3 雙鏈cDNA的擴增及純化 分別取純化前后的dscDNA 4 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明，純化后的dscDNA較純化前剔除掉了小于200 bp的片段，且純化后的dscDNA主要集中在200～2000 bp之間，表明分布比較完整（圖3）。

圖3 柔嫩艾美耳球蟲子孢子雙鏈cDNA純化前后電泳結果Fig.3 Electrophoretogram of unpurif ed and purif ed double-stranded cDNA of sporozoite of Eimeria tenella

圖4 柔嫩艾美耳球蟲子孢子文庫插入片段cDNA的 PCR鑒定Fig.4 PCR identif cation of the inserted fragments size ofcDNA lbrary from sporozoite of Eimeria tenella

2.4 文庫質量的鑒定 通過對SD/-Leu平板上的菌落計數(shù)，經(jīng)公式計算得到子孢子cDNA文庫轉化效率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫滴度為3.62×107cfu/mL。隨機挑取32個單克隆進行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，結果顯示條帶主要集中在400～2 000 bp之間，平均長度約為1000 bp，有2個單克隆沒有轉化成功，表明文庫重組率為93.75%（圖4）。2.5 特異性引物擴增獲得球蟲基因 以柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫反復凍融離心獲得的上清作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲5個特異基因的引物進行PCR擴增。電泳檢測結果表明，擴增出了5個特異性基因（ETH_00007915、ETH_00008865、EtCHP317、EtMIC2 、EtADF）（圖5），測序后進行比對，與原序列100%同源，表明所構建的柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫質量較好，包含有該階段所表達的特異性基因，可用于后續(xù)的研究。

M: DNA分子量標準(DL2000); 1: ETH_00007915; 2: ETH_00008865; 3: EtCHP317; 4: EtMIC2; 5: EtADFM: DNA Marker(DL2000); 1: ETH_00007915; 2: ETH_00008865; 3: EtCHP317; 4: EtMIC2; 5: EtADF

3 討論

構建一個高質量的酵母cDNA文庫是在真核細胞體內(nèi)高效、大量地篩選與已知蛋白有互作關系的蛋白以及研究蛋白間功能的前提。本研究分離純化獲得柔嫩艾美耳球蟲子孢子，提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測得OD260/OD280為1.97，28S、18S和5S條帶清晰，說明提取的總RNA質量良好，能用于后續(xù)的實驗。直接用總RNA反轉錄合成第一鏈，避免了mRNA在分離過程中被污染和降解，再用LD-PCR合成dscDNA，經(jīng)過柱純化后的dscDNA較純化之前，剔除了200 bp以下的小片段，避免了其在后期篩選過程中的干擾，可減少假陽性。能用于酵母雙雜交系統(tǒng)的高質量cDNA文庫須滿足以下條件，文庫的轉化率大于3.3×105/μg pGADT7-Rec，文庫容量大于2.0×107cfu/mL，重組率大于90%。經(jīng)過鑒定，本研究構建的柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫的轉化效率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫容量為3.62×107cfu/mL，重組率為93.75%。同時，根據(jù)實驗室前期已研究的柔嫩艾美耳球蟲特異性基因，以該文庫為模板，成功克隆出了長度不同的5個球蟲特異性基因，說明本研究構建的子孢子酵母cDNA文庫可用于后續(xù)的相互作用蛋白的篩選。

本文庫在構建時選用的引物是CDS Ⅲ（OligodT），較Random Primer有一定的優(yōu)勢。利用Oligo-dT擴增時，逆轉錄酶MMLV-RT通過OligodT Primer與mRNA的PolyA結合而延伸，當延伸到mRNA的5' 端遇到“帽子結構”時，會在已合成的cDNA 3' 端加上幾個C堿基。這時Oligo（dG）會與cDNA末端突出的C堿基進行配對，逆轉錄酶自動轉換模板，以SMART引物為模板繼續(xù)延伸至末端，獲得的cDNA一端有Oligo-dG，另一端有Oligo-dT已知序列。根據(jù)已知序列設計上、下游引物進行LDPCR就會擴增出大量的全長雙鏈cDNA，保證了基因的完整性[12,13]。而Rondom Primer上的6個隨機堿基是自由結合在mRNA的任何部位，由于該引物的特異性不強，擴增得到的大部分是一些片段基因，很少能得到全長基因。這樣就有可能導致一些基因重要結構域的不完整或者缺失，不利于后期的篩選。

酵母雙雜交cDNA文庫的構建在球蟲研究中已有應用。薛璞等[14]構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫，且利用該文庫篩選了柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1（EtAMA1）可能的相互作用蛋白。本研究構建的子孢子酵母雙雜交cDNA文庫選用的酵母菌株是Y187，因此在篩選文庫時所用誘餌菌株應為Y2HGold。薛璞等[14]構建的子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的酵母菌株是AH109，誘餌菌株是Y187。酵母菌株Y2HGold與AH109兩者的區(qū)別在于，Y2HGold菌株中的AUR1基因某個堿基發(fā)生了突變，即AUR1-C，突變后的菌株能夠對金擔子素A（aureobasidin A，AbA）產(chǎn)生抗性，而AH109不包含這個突變基因，對AbA敏感[15]。所以在后期文庫篩選中AUR1-C作為一個報告基因，使得篩選條件更加的嚴格，減少了假陽性產(chǎn)生的幾率。

近年來，隨著cDNA文庫技術的不斷改進和完善，使得酵母雙雜交方法的應用更加廣泛。Li等[16]利用酵母雙雜交方法獲得了與日本血吸蟲抱雌溝蛋白互作的5個蛋白的ESTs序列。Wang等[17]利用酵母雙雜交篩選獲得了與MIC2整合素A樣結構相互作用的2個宿主蛋白LAMTOR1、RNaseH2B。Leneghan等[18]將親免素（PfFKBP）作為誘餌，用酵母雙雜交的方法從瘧原蟲cDNA文庫中篩選到了11個可能與免疫抑制有關的基因。這些研究為以后利用酵母雙雜交cDNA文庫篩選寄生蟲功能基因提供了新的思路和方法。本研究成功構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，為進一步篩選與球蟲入侵相關的蛋白及功能基因奠定了基礎。

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CONSTRUCTION OF A YEAST TWO-HYBRID CDNA LIBRARY FROM SPOROZOITES OF EIMERIA TENELLA

XU Shuai-bing1, HUANG Bing1,3, ZHAO Qi-ping1, DONG Hui1, ZHU Shun-hai1, CUI Xiao-xia1, XIE Yu-xiang1, TANG Min1,2, YANG Zhi-yuan1,2, HAN Hong-yu1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitolgy of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to screen the proteins related to the invasion of Eimeria tenella sporozoites, the yeast two-hybrid cDNA library of E. tenella sporozoites was constructed in the present study. The total RNA was isolated from the sporozoites and used as the template to synthesize the f rst-strand cDNAs. The dscDNAs were acquired by long-distance polymerase chain reaction (LD-PCR) using the f rststrand cDNAs as the template and purified with Chroma Spin TE-400 Column to remove less than 200 bp fragments. The dscDNA,pGADT7-Rec and CarrierDNA were co-transformed into Y187 yeast competent cells. The dscDNA were then connected with pGADT7-Rec by homologous recombination reaction to construct the yeast two-hybrid cDNA library of E. tenella sporozoites. The results showed that the conversion ratio and titer of the cDNA library were 4.33×105/μg pGADT7-Rec and 3.62×107cfu/mL, respectively. As demonstrated in PCR amplif cation, the cDNA library contained approximately 93.75% recombinant clones and the inserted cDNA fragments were between 200 bp and 2000 bp. Furthermore, 5 gene fragments were obtained by PCR amplication using the cDNA library as template and 5 specif c pairs of primers of E. tenella. Therefore, it concluded that a yeast two-hybrid cDNA library of the sporozoites was constructed for screening invasion-related interaction proteins of the sporozoites of E. tenella.

Eimeria tenella; sporozoite; yeast two-hybrid cDNA library; homologous recombination

S852.723

A

1674-6422（2016）06-0036-07

2016-09-08

國家自然科學基金（31272557，31572266）；農(nóng)業(yè)部中央級公益性科研院所項目（2015JB10）

徐帥兵，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

韓紅玉，E-mail∶ hhysh@shvri.ac.cn