方芳，蔡軍波，王萍

（臺(tái)州市立醫(yī)院，浙江 臺(tái)州318000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

歐前胡素逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗性及機(jī)制研究

方芳，蔡軍波，王萍

（臺(tái)州市立醫(yī)院，浙江 臺(tái)州318000）

目的 探討歐前胡素逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑抵抗性的機(jī)制。 方法 將順鉑耐藥Hela細(xì)胞（Hela/R細(xì)胞）按對(duì)照組、歐前胡素組、順鉑組、歐前胡素+順鉑組及歐前胡素+順鉑+Bim siRNA組進(jìn)行分組后，采用MTT法檢測Hela/R的細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測Hela/R細(xì)胞的凋亡，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Hela/R細(xì)胞Bim蛋白與Bak及Bax蛋白的相互作用，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測Hela/R細(xì)胞色素c的釋放和caspase-3的活化。 結(jié)果 Hela/R細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50顯著高于常規(guī)Hela細(xì)胞（P＜0.05）。歐前胡素處理可誘導(dǎo)Hela/R細(xì)胞Bim蛋白的上調(diào)及其與Bak、Bax蛋白的相互作用。歐前胡素+順鉑組對(duì)Hela/R細(xì)胞活力的抑制率和凋亡誘導(dǎo)率顯著高于順鉑組和歐前胡素+順鉑+Bim siRNA組。歐前胡素+順鉑組對(duì)Hela/R細(xì)胞色素c的釋放和caspase-3的活化顯著高于順鉑組和歐前胡素+順鉑+Bim siRNA組。 結(jié)論 歐前胡素通過上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)提高順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

宮頸癌；順鉑；歐前胡素；Bim；Bak；Bax

化療是宮頸癌治療中不可替代的方法，其療效在很大程度上決定了宮頸癌患者的預(yù)后[1]。然而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的獲得性藥物抵抗嚴(yán)重影響化療的效果[2]。本研究的目的在于探討歐前胡素是否能逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗性并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 順鉑、歐前胡素、噻唑藍(lán) [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]，凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。Bim、Bak、Bax、細(xì)胞色素c、活化caspase-3和β-actin抗體購于美國Cell Signaling公司。ECL試劑盒購于美國Pierce公司。細(xì)胞線粒體分離試劑盒購于江蘇碧云天生物科技有限公司。Bim siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究從2014年8月～2016年 6月完成于本院實(shí)驗(yàn)室。人宮頸癌細(xì)胞系Hela購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細(xì)胞每2～3天傳代1次，傳代時(shí)用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1∶3稀釋后傳代。順鉑耐藥Hela（Hela/R）細(xì)胞用順鉑梯度處理法進(jìn)行誘導(dǎo)構(gòu)建，簡要步驟如下∶將常規(guī)Hela細(xì)胞用含0.5μmol/L順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)3個(gè)月，之后每3周將順鉑濃度提高0.1μmol/L，最終使Hela細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)在含1.5μmol/L順鉑的培養(yǎng)基中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 順鉑半數(shù)有效濃度（IC50）測定 將常規(guī)Hela或Hela/R細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜，分為常規(guī)Hela細(xì)胞組和Hela/R細(xì)胞組，將兩組細(xì)胞用不同濃度的順鉑處理48小時(shí)后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)并繪制細(xì)胞活力-順鉑濃度曲線，根據(jù)曲線計(jì)算順鉑對(duì)常規(guī)Hela細(xì)胞和Hela/R細(xì)胞的IC50。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 將Hela/R細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、歐前胡素組、順鉑組、歐前胡素+順鉑組及歐前胡素+順鉑+Bim siRNA組，分組培養(yǎng)方法詳見表1，藥物處理時(shí)間為48小時(shí)。藥物處理完畢后進(jìn)行MTT試驗(yàn)，步驟如下∶在經(jīng)過藥物處理的Hela/ R細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5mg/mL MTT 20μL培養(yǎng)4小時(shí)，棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算∶抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

表1 Hela/R細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組方法

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將Hela/R細(xì)胞按上述要求分組處理，之后按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶 （PI）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.2.4 免疫共沉淀 各組細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，裂解產(chǎn)物在12000轉(zhuǎn)/min下離心15分鐘，取上清液，分成等量2份。1份上清液用于檢測βactin的表達(dá)作為對(duì)照，另1份上清液在其中加入Bim抗體孵育過夜后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2小時(shí)。將Bim抗體孵育后的產(chǎn)物在1200轉(zhuǎn)/min低速下離心5分鐘，小心吸去上清液留取瓊脂糖珠。瓊脂糖珠用細(xì)胞裂解液重懸后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)用于檢測Bim與Bak及Bax蛋白的相互作用。

1.2.5 線粒體分離 將Hela/R細(xì)胞按上述要求分組處理，之后用細(xì)胞線粒體分離試劑盒將腫瘤細(xì)胞的線粒體分離出來，細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)用于檢測細(xì)胞色素c的釋放。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將Hela/R細(xì)胞按上述要求分組處理，之后將細(xì)胞用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，裂解產(chǎn)物在12000轉(zhuǎn)/min下離心15分鐘，提取總蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn) （免疫共沉淀產(chǎn)物或線粒體分離試劑盒分離出的細(xì)胞質(zhì)可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。將樣品用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用Bim、Bak、Bax、細(xì)胞色素c、活化caspase-3和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2小時(shí)，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素抑制Hela/R細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗性測定常規(guī)Hela細(xì)胞Hela/R細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，結(jié)果顯示順鉑對(duì)Hela/R細(xì)胞的IC50顯著高于常規(guī)Hela細(xì)胞，分別為（43.6±3.2）μmol/L和（5.7±0.5）μmol/L（P<0.05）。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合歐前胡素處理后，順鉑對(duì)Hela/R細(xì)胞的活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率都顯著提高 （表2）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示歐前胡素處理能顯著上調(diào)Hela/R細(xì)胞Bim蛋白的表達(dá)水平，而順鉑處理對(duì)Bim無影響，詳見圖1。同時(shí)，當(dāng)用Bim siRNA阻斷Bim蛋白的上調(diào)后，歐前胡素對(duì)順鉑的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)受到明顯抑制（表2），表明歐前胡素提高耐藥宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的機(jī)制和Bim蛋白的上調(diào)有關(guān)。

表2 歐前胡素提高順鉑對(duì)Hela/R細(xì)胞的抗腫瘤活性（）

表2 歐前胡素提高順鉑對(duì)Hela/R細(xì)胞的抗腫瘤活性（）

與對(duì)照組比較*P<0.05，與順鉑組比較△P<0.05，與歐前胡素+順鉑組比較▲P<0.05

組別 n/孔 細(xì)胞活力抑制率（%） 凋亡誘導(dǎo)率（%）對(duì)照組 3 0 1.8±0.2歐前胡素組 3 7.6±0.6 4.6±0.3順鉑組 3 13.2±1.1*9.4±0.5*歐前胡素+順鉑組 3 58.5±4.2△35.8±2.7△歐前胡素+順鉑+ Bim siRNA組 3 20.8±1.9▲12.6±1.2▲

圖1 歐前胡素上調(diào)Hela/R細(xì)胞Bim蛋白的表達(dá)水平

2.2 歐前胡素促進(jìn)Bim蛋白與Bak、Bax蛋白的相互作用 免疫共沉淀結(jié)果顯示，Hela/R細(xì)胞在經(jīng)過歐前胡素處理后，與Bim蛋白結(jié)合的Bak、Bax蛋白水平顯著提高，詳見圖2。

圖2 Bim蛋白免疫共沉淀

2.3 歐前胡素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)Hela/R細(xì)胞色素c的釋放和caspase-3的活化 Western blot結(jié)果顯示歐前胡素聯(lián)合順鉑處理后，Hela/R細(xì)胞色素c的釋放和caspase-3的活化顯著提高，詳見圖3。

圖3 Hela/R細(xì)胞色素c的釋放和caspase-3的活化

3 討論

順鉑是治療宮頸癌的重要化療藥物，能與細(xì)胞中的DNA發(fā)生結(jié)合從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。但重復(fù)給藥可能造成宮頸癌細(xì)胞的獲得性藥物抵抗，從而降低化療的效果。因此通過輔助治療手段提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，減弱獲得性藥物抵抗是提高順鉑療效的途徑。歐前胡素是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)，據(jù)報(bào)道有一定的抗腫瘤效應(yīng)[4]。然而，歐前胡素是否對(duì)已產(chǎn)生獲得性順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞有藥物增敏效應(yīng)至今還未見報(bào)道。本研究表明，已產(chǎn)生獲得性順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑高度耐藥，然而在使用順鉑的同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用歐前胡素后，順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞發(fā)生了顯著的凋亡，表明歐前胡素能提高順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，是良好的輔助治療藥物。

Bim是一種Bcl-2促凋亡蛋白家族成員，主要分布在線粒體的外膜，參與線粒體膜孔道的調(diào)節(jié)[5]。文獻(xiàn)報(bào)道[6]Bim的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性高度相關(guān)，Bim基因的沉默可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡通路的失敏和藥物療效的下降。本研究證實(shí)歐前胡素能通過上調(diào)順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞中Bim蛋白的表達(dá)而增強(qiáng)順鉑對(duì)該耐藥腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，這與文獻(xiàn)報(bào)道[6]一致。當(dāng)用小干擾RNA抑制Bim基因的表達(dá)后，歐前胡素的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)明顯減弱，表明歐前胡素發(fā)揮作用的機(jī)制可能和Bim蛋白的上調(diào)有關(guān)。

線粒體途徑的凋亡是多種化療藥物發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制，主要由Bcl-2蛋白家族進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]。Bim蛋白在腫瘤細(xì)胞中能與Bak和Bax蛋白發(fā)生相互作用，從而發(fā)生活化并導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的變化。在DNA損傷等凋亡信號(hào)下，活化的Bak和Bax能在線粒體外膜表面形成通透性外膜孔道，使線粒體中的細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活caspase-3，使細(xì)胞最終發(fā)生凋亡性死亡[8-9]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，歐前胡素可以通過上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)，促進(jìn)其與Bak、Bax蛋白的相互作用， 發(fā)生活化，從而使順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞在順鉑作用下打開線粒體的通透性膜孔道，釋放其中的細(xì)胞色素c，最終誘導(dǎo)caspases依賴的凋亡[10]。

綜上所述，本研究證明了歐前胡素能顯著提高耐藥宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性并能通過Bim-Bak/Bax途徑，誘導(dǎo)耐藥宮頸癌細(xì)胞在順鉑作用下發(fā)生線粒體途徑的凋亡，這些研究為逆轉(zhuǎn)宮頸癌的化療耐藥提供了新的思路和理論依據(jù)。

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