梁 敏，王海峰，王劍松，楊 宏

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·論著·

膀胱尿路上皮癌標本中人微小核糖核酸3658與人源性長壽保障基因Ⅱ型基因表達的相關(guān)性及其臨床意義

梁 敏，王海峰，王劍松，楊 宏

【摘要】目的探討人微小核糖核酸3658(miR-3658)和人源性長壽保障基因Ⅱ型(LASS2)在臨床膀胱尿路上皮癌標本中的表達差異及相關(guān)性。方法收集昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院和云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科2014年1月—2015年1月收治的膀胱癌患者96例，在膀胱癌根治術(shù)中獲取膀胱癌組織和癌旁組織。采用實時熒光定量PCR測定膀胱癌組織和癌旁組織miR-3658及LASS2 mRNA表達水平；采用免疫組化法檢測膀胱癌組織和癌旁組織LASS2蛋白表達情況。結(jié)果膀胱癌組織miR-3658 mRNA表達水平高于癌旁組織，LASS2 mRNA表達水平低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(t=6.46、38.12，P<0.01)。不同復發(fā)性、病理分級、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期者miR-3658、LASS2 mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LASS2蛋白表達定位于胞質(zhì)中，呈棕色或黃褐色顆粒狀。膀胱癌組織LASS2蛋白陽性表達率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.32，P<0.01)。不同復發(fā)性、病理分級、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期者LASS2蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，膀胱癌組織LASS2 mRNA表達水平與miR-3658 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.676，P<0.05)。結(jié)論miR-3658與LASS2在膀胱癌組織中的表達呈負相關(guān)，miR-3658可能通過調(diào)節(jié)LASS2表達而參與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的過程。

本研究背景：

膀胱癌由于高復發(fā)率和高轉(zhuǎn)移能力而預(yù)后不良，如何防止腫瘤復發(fā)及抑制疾病的進展是該病治療面臨的挑戰(zhàn)。尋求新的有效的生物預(yù)后標志物和治療靶標，探索更有效的個性化治療策略是關(guān)鍵。為此，探討膀胱癌組織中人微小核糖核酸(miRNA)和相關(guān)基因的異常表達及與臨床病理特征間的關(guān)系是重要的第一步。膀胱癌在惡性腫瘤中占1%～2%，其中90%以上為膀胱尿路上皮癌[1]。人微小核糖核酸(miRNA)通過調(diào)控基因表達，參與到腫瘤細胞的多項生物學行為已得到廣泛證實[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，人源性長壽保障基因Ⅱ型(homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)在不同膀胱癌組織中存在表達差異[3]。本研究預(yù)實驗通過基因芯片及生物信息學預(yù)測技術(shù)，篩選出不同組織標本(包括膀胱癌組織、癌旁正常組織、LASS2高表達的膀胱癌組織、LASS2低表達的膀胱癌組織)中差異表達而且與LASS2存在相互作用且最相關(guān)的miRNA為miR-3658，推測miR-3658可能與靶向LASS2的3′末端非翻譯區(qū)(3′ untranslated regions，3′ UTR)結(jié)合，參與到膀胱癌調(diào)控機制。因此，本研究對臨床膀胱尿路上皮癌標本中miR-3658和LASS2的表達水平進行了初步研究。

1材料與方法

1.1材料和組織收集昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院和云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科2014年1月—2015年1月收治的膀胱癌患者96例，其中男74例，女22例；年齡32～67歲，平均年齡(47.6±9.4)歲；腫瘤分期：T1期12例，T2期49例，T3期30例，T4期5例，術(shù)后病理均證實為膀胱尿路上皮癌。膀胱癌組織及癌旁組織均在膀胱癌根治性手術(shù)中獲得，收集新鮮膀胱癌組織立即置于-80 ℃液氮中，保存直至RNA提取。相應(yīng)的癌旁組織為至少遠離癌組織2 cm以上的正常膀胱組織，采用相同的方法保存用作對照。

1.2儀器與試劑RM2135石蠟切片機和300型染色機(美國Leica公司)，小鼠抗人LASS2蛋白多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司15596-026)，即用型DAB免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物公司)，miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化)，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)，miRNA熒光定量檢測試劑盒(大連寶生物)，Quant反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化)，普通熒光定量檢測試劑盒(美國KAPA bio公司)。

1.3實驗方法

1.3.1總RNA提取(Trizol法提取)標本總RNA提取，按照invitrogen公司的操作說明進行。RNA用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳緩沖液；150 V 15 min。紫外分光光度法檢測OD260/OD280，確定其純度及濃度進行質(zhì)量控制。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(for mRNA)按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成用于mRNA檢測的cDNA第一鏈。反應(yīng)體系：5×RT Buffer，2 μl，RT Enzyme Mix 0.5 μl，Primer Mix 0.5 μl，RNA 0.5 pg～1.0 μg，加無核酸酶水(Nuclease-free Water)至總體積10 μl，合成的cDNA于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3Poly(A)加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄(for miRNA)按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明，在miRNA 3′末端加多聚A尾Poly(A)，再進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA對應(yīng)的cDNA第一鏈。反應(yīng)體系：Poly(A)反應(yīng)液2 μl，10×RT Primer 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)1 μl，RNasin(40 U/μl)1 μl，Quant RTase 0.5 μl，無RNA酶的雙蒸水(RNase-Free ddH2O)11.5 μl。37 ℃反應(yīng)60 min。

1.3.4實時熒光定量PCR反應(yīng)(for mRNA)選用GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列為GAPDH-F：5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′，GAPDH-R：5′-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3′，LASS2-F：5′-TCTCCTGGTTTGCCAATTACG-3′，LASS2-R：5′-CCGGGCAGGGACCCTCATCA-3′。反應(yīng)體系：RNase-free ddH2O 7 μl，KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2×)10 μl，正向引物(10 μmol/L)0.4 μl，反向引物(10 μmol/L)0.4 μl，模板cDNA 1.8 μl，ROX染料0.4 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)30次。實時定量分析采用2-△△Ct法。

1.3.5實時熒光定量PCR反應(yīng)(for miRNA)選用U6作為內(nèi)參基因，引物序列為U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，miR-3658-F：5′-GTGGGGGTTTAAGAAAACACCAT-3′，miR-3658-R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，miR-3658 stem loop：5′-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAG-CCAAC ATCTCC-3′，下游通用引物：試劑盒自帶。反應(yīng)體系：SYBR Premix EX Taq Ⅱ(2×)10 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl，Uni-miR qPCR Primer(10 μmol/L)0.8 μl，模板cDNA 2 μl，RNase-free ddH2O 6.4 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，循環(huán)40次。實時定量分析采用2-△△Ct法，ΔCt=Ct(miR-3658)-Ct(U6)，所有標本重復3孔。

1.3.6免疫組化檢測LASS2表達及細胞定位參照即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2試劑盒(鼠)說明書(編號：40462a)進行免疫組化操作。LASS2陽性結(jié)果判定：每張組織切片隨機進行10個高倍視野的觀察(HPEs×200)，計數(shù)100個腫瘤樣細胞。以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色的染色細胞為陽性。染色<25%，細胞無染色或者弱染色及中等程度染色記(-)；染色25%～50%，細胞中等至強染色記(+)；染色>50%，強染色記(++)。

2結(jié)果

2.1膀胱癌組織和癌旁組織miR-3658、LASS2mRNA表達水平比較膀胱癌組織miR-3658表達水平為(4.15±2.78)，LASS2表達水平為(11.83±3.62)；癌旁組織miR-3658表達水平為(2.17±1.14)，LASS2表達水平為(28.21±2.15)。膀胱癌組織miR-3658表達水平高于癌旁組織，LASS2表達水平低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(t=6.46、38.12，P<0.01)。

2.2不同臨床特征者miR-3658、LASS2mRNA表達水平比較不同復發(fā)性、病理分級、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期者miR-3658、LASS2mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤大小、多發(fā)性者miR-3658、LASS2mRNA表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

2.3LASS2免疫組化LASS2蛋白表達定位于胞質(zhì)中，呈棕色或黃褐色顆粒狀(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net)。膀胱癌組織LASS2蛋白陽性表達率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.32，P<0.01，見表2)。

Table1　ComparisonofmiR-3658andLASS2mRNAexpressionofpatientswithdifferentclinicfeatures

臨床特征例數(shù)miR-3658mRNA水平 t值 P值LASS2mRNA水平 t值 P值臨床特征例數(shù)miR-3658mRNA水平 t值 P值LASS2mRNA水平 t值 P值性別0.5160.1820.6210.121病理分級31.39<0.0107.024<0.010 男742.61±1.217.89±3.57 高分化491.19±0.3211.06±1.12 女222.53±0.928.26±4.62 低分化474.10±0.857.93±4.22年齡(歲)1.5543.4050.9600.268浸潤深度7.7760.0088.190<0.010 ≥50363.12±0.289.72±3.23 T1+T2612.14±2.039.62±2.22 <50603.76±1.829.17±5.44 T3+T4353.98±1.126.12±3.55腫瘤大小(cm)0.5651.2381.3510.083淋巴轉(zhuǎn)移18.240.03213.07<0.050 ≥3532.82±0.279.72±3.25 無642.14±0.7710.82±1.67 <3432.62±1.568.93±4.72 有323.98±0.625.98±3.22原發(fā)/復發(fā)12.000<0.0505.470<0.050遠處轉(zhuǎn)移15.940.0137.6550.009 原發(fā)631.48±0.5610.18±3.24 無862.03±0.8410.20±1.78 復發(fā)333.93±1.927.63±3.22 有103.83±0.728.73±0.61單發(fā)/多發(fā)1.3210.6232.0610.168TNM分期(期)24.90<0.0506.7570.011 單發(fā)423.27±1.929.62±3.22 Ⅰ+Ⅱ551.63±0.665.26±1.62 多發(fā)543.55±0.798.85±1.74 Ⅲ+Ⅳ414.02±0.677.82±3.34

表2膀胱癌組織和癌旁組織LASS2蛋白陽性表達情況比較

〔n(%)〕

Table 2Comparison of LASS2 protein positive expression between bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues

組織例數(shù)LASS2蛋白表達陽性 陰性膀胱癌組織9639(40.6)57(59.4)癌旁組織9666(68.8)30(31.2)

2.4不同臨床特征者LASS2蛋白陽性表達率比較不同復發(fā)性、病理分級、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期者LASS2蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而不同性別、年齡、腫瘤大小、多發(fā)性、遠處轉(zhuǎn)移者LASS2蛋白陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

注：A為(-)(×100)，B為(+)(×100)，C為(++)(×100)，D為(-)(×200)，E為(+)(×200)，F(xiàn)為(++)(×200)

圖1　LASS2蛋白表達情況

2.5miR-3658和LASS2 mRNA表達水平在膀胱癌組織中的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，LASS2 mRNA表達水平與miR-3658 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.676，P<0.05)。

3討論

LASS2基因也稱腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子1(tumor metastasis suppressor gene 1，TMSG1)，與多種癌癥的浸潤、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，包括前列腺癌、肝癌、乳腺癌、腦膜癌等[4-7]。在本實驗中，分別采用實時定量PCR和免疫組化法檢測LASS2的表達，結(jié)果顯示膀胱癌組織LASS2 mRNA表達水平低于癌旁組織，其表達水平與癌細胞病理分級、腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期以及腫瘤復發(fā)特征相關(guān)；膀胱癌臨床分期越晚、腫瘤細胞惡性程度越高、侵襲能力越強，LASS2 mRNA表達水平越低。

在膀胱癌方面，目前關(guān)于LASS2的研究較少。有學者發(fā)現(xiàn)增殖和侵襲能力較高的EJ-M3和BIU-87的LASS2表達水平最低，而另外兩株低轉(zhuǎn)移的膀胱癌細胞中LASS2的表達相對較高[8-9]，并且發(fā)現(xiàn)LASS2基因與臨床分期、浸潤深度、復發(fā)性緊密相關(guān)，LASS2表達陰性的膀胱癌患者具有較差的預(yù)后[3]，與本實驗結(jié)果基本一致。因此推測LASS2參與了膀胱癌細胞增殖和浸潤過程中的信號通路，從而影響了膀胱癌細胞株的增殖浸潤能力，具體可能與胞質(zhì)內(nèi)神經(jīng)酰胺以及囊泡型ATP酶(vacuolar ATPase，V-ATPase)的表達調(diào)節(jié)作用相關(guān)。本實驗結(jié)果證實，LASS2蛋白表達定位于胞質(zhì)中，而該蛋白的TLC結(jié)構(gòu)域影響二氫神經(jīng)酰胺的合成，而后者作為細胞信號傳遞的第二信使，影響細胞凋亡和細胞周期的調(diào)控，從而抑制癌細胞的增殖浸潤過程。同時，LASS2基因的表達與V-ATPase相互作用，降低質(zhì)子泵跨膜運輸H+的能力，通過影響細胞內(nèi)外的酸堿度，實現(xiàn)抑制癌細胞增殖生長以及浸潤轉(zhuǎn)移功能[10-12]。

miRNA是一類非編碼單鏈微小RNA，其可能通過參與調(diào)控基因表達而參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展。本實驗檢測miR-3658的表達水平，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織miR-3658 mRNA表達水平高于癌旁組織，其表達水平與膀胱癌浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、病理分級、TNM分期及復發(fā)性等相關(guān)；膀胱癌臨床分期越晚、腫瘤細胞惡性程度越高、侵襲能力越強、遠處轉(zhuǎn)移，miR-3658 mRNA表達水平越高。Hao等[13]發(fā)現(xiàn)miR-3658在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的表達水平較正常人顯著升高。與本實驗比較，雖然腫瘤的種類不同，但是結(jié)果相一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-3658與LASS2 mRNA表達水平均與遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，腫瘤遠處轉(zhuǎn)移時，LASS2 mRNA表達水平降低，而miR-3658 mRNA表達水平增高。目前研究發(fā)現(xiàn)，癌癥的遠處轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)具有緊密相關(guān)性。而在癌癥的遠處轉(zhuǎn)移過程中，一些miRNAs能夠調(diào)控EMT相關(guān)的靶基因，影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此猜測miR-3658在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中可能起到一定的作用。

本研究結(jié)果亦表明，miR-3658及LASS2在膀胱癌組織中均呈差異性表達，而且，兩者的表達水平呈顯著負相關(guān)。特別的是，miR-3658及LASS2差異性表達相關(guān)的臨床病理參數(shù)較為一致，均為膀胱癌的浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、病理分級、腫瘤TNM分期及復發(fā)性腫瘤。原癌基因和抑癌基因的激活方式主要有基因突變、基因插入、基因擴增、染色體易位等。由于miRNAs分子量較小，比較容易受到上述影響從而改變其在細胞內(nèi)的表達水平，調(diào)控靶基因表達，可能改變細胞的癌變進程?；诖?，miR-3658可能通過參與到LASS2某種信號通路，在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。但由于本實驗僅限于miR-3658和LASS2基因在組織中的表達水平變化的分析，所以不能提供充分的證據(jù)去驗證這個觀點，相關(guān)的研究工作還有待深入進行。

作者貢獻：梁敏進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；王海峰進行實驗設(shè)計、分析數(shù)據(jù)、質(zhì)量控制及審校，并對文章負責；王劍松指導實驗設(shè)計和實施；楊宏進行實驗實施、評估、資料收集。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

【關(guān)鍵詞】膀胱腫瘤；微小核糖核酸；人源性長壽保障基因Ⅱ型；相關(guān)性

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Correlation of miR-3658 and Homo Sapiens Longevity Assurance Homologue 2 Expression in Bladder Urothelial Carcinoma Samples and Its Clinical SignificanceLIANGMin，WANGHai-feng，WANGJian-song，etal.DepartmentofUrology，the5thAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Gejiu661000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression differences and correlation of microRNA-3658(miR-3658)and homo sapiens longevity assurance homologue 2(LASS2)in clinical bladder urothelial carcinoma samples.MethodsWe collected 96 patients with bladder urothelial carcinoma from the Departments of Urology in the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University and Yunnan Cancer Hospital from January 2014 to January 2015；bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues were obtained from radical resection of bladder urothelial carcinoma.Hsa-miR-3658 and LASS2 mRNA expression in bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues were detected by real-time fluorescence quantification PCR；LASS2 protein expression in bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues was detected by immunohistochemistry(IHC).ResultsmiR-3658 mRNA expression was higher in bladder cancer tissues than paracarcinoma tissues；and LASS2 mRNA expression was lower in bladder cancer tissues than paracarcinoma tissues；the two differences were both significant(t=6.46，38.12；P<0.01).miR-3658 mRNA and LASS2 mRNA expression were significantly different among patients with different recurrence status，pathological grade，infiltration depth，lymphatic metastasis，distal metastasis and TNM stages(P<0.05).LASS2 protein located in cytoplasm was brown or yellow-brown granules.The positive expression rate of LASS2 protein was lower in bladder cancer tissues than paracarcinoma tissues(χ2=15.32，P<0.01).The positive expression rate of LASS2 protein was significantly different among patients with different recurrence status，pathological grades，infiltration depth，lymphatic metastasis and TNM stages(P<0.05).Pearson correlation analysis results showed LASS2 mRNA and miR-3658 mRNA expression were negatively correlated in bladder cancer tissues(r=-0.676，P<0.05).ConclusionmiR-3658 expression is negatively correlated with LASS2 expression in bladder cancer tissues，and miR-3658 may participate in the occurrence and development of bladder cancer by regulating the LASS2 expression.

【Key words】Urinary bladder neoplasms；MicroRNA；LASS2；Correlation

(收稿日期：2015-09-24；修回日期：2015-12-01)

【中圖分類號】R 737.14

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.05.013

通信作者：王海峰，650101云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所；E-mail：highphone@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81260374；81460384)；云南省教育廳基金資助項目(2014Z072)；云南省科技廳面上項目(2015FB196)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項(2014FA015；2014FZ031)；云南省衛(wèi)生廳內(nèi)設(shè)機構(gòu)項目(2014NS081)
作者單位：661000云南省個舊市，昆明醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院 紅河州滇南中心醫(yī)院泌尿外科(梁敏)；昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所(梁敏，王海峰，王劍松)；昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科(楊宏)