佟昌慈，　柳云恩，　張玉彪，　施　琳，　劉　穎，　劉學(xué)磊，　叢培芳，

金紅旭1,2，　高　燕1,2，　侯明曉1,2

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院　1.急診科；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室及

遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng)　110016

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體外膜肺氧合對(duì)撞擊傷致急性肺損傷細(xì)胞因子表達(dá)影響

佟昌慈1,2，柳云恩1,2，張玉彪1,2，施琳1,2，劉穎1,2，劉學(xué)磊1,2，叢培芳1,2，

金紅旭1,2，高燕1,2，侯明曉1,2

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院1.急診科；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室及

遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng)110016

摘要：目的篩選體外膜肺氧合(ECMO)救治嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的特異細(xì)胞因子。方法將20只Beagle犬隨機(jī)分為正常實(shí)驗(yàn)犬組(對(duì)照組)；橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型組(模型組)；橡皮彈撞擊至犬肺損傷，機(jī)械通氣治療組(機(jī)械通氣組)；以及橡皮彈撞擊至犬肺損傷，ECMO治療組(ECMO組)。解剖取肺組織提取總蛋白質(zhì)并應(yīng)用蛋白芯片檢測(cè)篩選差異表達(dá)的細(xì)胞因子。結(jié)果在檢測(cè)的20個(gè)細(xì)胞因子中，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干細(xì)胞因子(SCF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子R(HGF-R)、白介素-1β(IL-1β)、主要內(nèi)在蛋白-1β(MIP-1β)和腫瘤壞死因子RIB(TNF-RIB)表達(dá)均增高；機(jī)械通氣組和ECMO組治療后上述各細(xì)胞因子表達(dá)均較治療前降低，且ECMO組差異更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；糖基化終末產(chǎn)物特異性受體(RAGE)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7(FGF-7)和白介素-12p40(IL-12p40)表達(dá)趨勢(shì)相反；4組集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；促紅細(xì)胞生成素(EPO)和干擾素-γ(IFN-γ)無(wú)表達(dá)。結(jié)論ECMO治療可改善重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)，為研究ECMO治療重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的分子機(jī)制提供方向和靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：急性肺損傷；體外膜肺氧合；機(jī)械通氣；蛋白芯片

車(chē)禍、礦山爆破以及墜落等撞擊導(dǎo)致的急性肺損傷是致病和死亡的主要因素，嚴(yán)重影響患者的生存率，其治療方法之一為機(jī)械通氣，若方法不當(dāng)則可加重病情[1]。體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)是一種將體內(nèi)靜脈血引流到體外，通過(guò)膜肺氧合后變?yōu)閯?dòng)脈血后，由驅(qū)動(dòng)泵輸送回體內(nèi)的心肺輔助技術(shù)，這種技術(shù)可以減輕呼吸和(或)循環(huán)衰竭患者的心肺負(fù)擔(dān)，減緩患者心肺損傷的病情發(fā)展，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間[2-5]。雖然ECMO的臨床研究及應(yīng)用已有多年，但是ECMO在治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷分子機(jī)制研究較少。

蛋白質(zhì)組學(xué)是用于分析細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)整體定性定量的研究方法，從蛋白整體水平上研究分析細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)及其相互作用關(guān)系。同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析也可以為未知分子機(jī)制的研究提供研究方向和靶點(diǎn)[6-8]。蛋白芯片技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有效技術(shù)之一。本研究利用蛋白芯片技術(shù)分析篩選ECMO治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷可能的分子機(jī)制。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組20只成年健康Beagle犬，體質(zhì)量30～34 kg，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(n=5)；模型組(n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型；機(jī)械通氣組(n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型，采用機(jī)械通氣治療；ECMO治療組(n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型，采用ECMO治療。所有實(shí)驗(yàn)犬均購(gòu)自于沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，食物及水由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型建立實(shí)驗(yàn)犬標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)2周，術(shù)前12 h禁食不禁水，固定于實(shí)驗(yàn)架上，常溫條件下18.4 mm橡皮彈5 m距離致胸部創(chuàng)傷。橡皮彈全彈重18.47～19.23 g、飛行彈重8.31～8.72 g、彈丸最大直徑18.16～18.83 mm、彈速106～125 m/s、動(dòng)能(E)59.73 J、比動(dòng)能(Es)21.69 J/cm2。

1.3機(jī)械通氣治療實(shí)驗(yàn)犬30 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射，麻醉后固定，仰臥在手術(shù)臺(tái)上。F6.0～F8.0氣管導(dǎo)管插入并連接呼吸機(jī)，呼吸頻率15次/min，F(xiàn)iO2為40%，氧濃度1.00%，潮氣量20 ml/kg。游離右側(cè)股動(dòng)脈，采集動(dòng)脈血標(biāo)本，肝素化置管后連接多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)。游離左側(cè)股靜脈，置管連接三通，連接輸液裝置。氣管插管和Y型管之間連接雙向流量壓力傳感裝置，連接多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，測(cè)量氣道壓力和流量的改變。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意麻醉深度，適時(shí)適量追加戊巴比妥鈉，0.03%的司可林維持實(shí)驗(yàn)犬肌松，自主呼吸消失為準(zhǔn)。

1.4ECMO治療術(shù)前1 mg阿托品腹腔注射，30 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉實(shí)驗(yàn)犬至睫反射消失，固定于手術(shù)臺(tái)上。F6.0～F8.0氣管插管，連接簡(jiǎn)易呼吸器、氧氣罐和氮?dú)夤?，維持實(shí)驗(yàn)犬的呼吸，調(diào)節(jié)氮?dú)?、氧氣的濃度比以降低吸入的氧氣濃度，將置入的熱稀釋?dǎo)管與有創(chuàng)動(dòng)脈血氧飽和度監(jiān)測(cè)儀和多功能監(jiān)護(hù)儀連結(jié)。游離雙側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈及右側(cè)頸靜脈，采用股靜脈—頸靜脈ECMO模式，實(shí)驗(yàn)犬的股靜脈插管和頸內(nèi)靜脈插管與ECMO系統(tǒng)相連，按右股靜脈-儲(chǔ)血器-滾壓泵-氧合器-右頸內(nèi)靜脈的順序連接。激活全血凝固時(shí)間(ACT)維持在140～200 s。體外循環(huán)開(kāi)始時(shí)，膜肺氣血比調(diào)至1∶1，氧合器清掃氣流為純氧，流量2～4 L/min。從心排量所能達(dá)到的最大值為體外循環(huán)血量開(kāi)始，轉(zhuǎn)流建立后，給予無(wú)氧呼吸(全氮?dú)?。維持動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)在90%時(shí)的體外循環(huán)血流量。

1.5肺組織標(biāo)本采集動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用股動(dòng)脈放血法處死實(shí)驗(yàn)犬，無(wú)菌條件下，迅速打開(kāi)胸腔，右肺門(mén)結(jié)扎，取出肺組織。取肺上葉分成若干個(gè)小部分，放入常規(guī)消毒處理后的EP管中，迅速放入液氮罐中，保存于-80℃低溫冰箱。

1.6總蛋白提取將凍存在液氮中的肺組織取出后融化，每50～100 mg組織加入0.5 ml組織裂解液，制備成組織勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心20 min后，取上層蛋白溶液于新EP管中。

1.7蛋白芯片檢測(cè)取實(shí)驗(yàn)犬肺組織提取全蛋白溶液，采用QAC-CYT-1及QAC-CYT-2蛋白芯片(匯佰生物科技有限公司)，檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1蛋白芯片篩選細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干細(xì)胞因子(SCF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子R(HGF-R)、白介素-1β(IL-1β)、主要內(nèi)在蛋白-1β(MIP-1β)和腫瘤壞死因子RIB(TNF-RIB)的表達(dá)量，模型組明顯高于對(duì)照組；與模型組比較，機(jī)械通氣組和ECMO組有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ECMO組與機(jī)械通氣組比較，下降幅度更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖基化終末產(chǎn)物特異性受體(RAGE)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7(FGF-7)和白介素-12p40(IL-12p40)的表達(dá)量，模型組低于對(duì)照組；與模型組比較，機(jī)械通氣組和ECMO治療組有一定量的上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與機(jī)械通氣組比較，ECMO治療組上升幅度更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)的表達(dá)量無(wú)明顯變化；促紅細(xì)胞生成素(EPO)和干擾素-γ(IFN-γ)無(wú)表達(dá)。見(jiàn)表1。

2.2蛋白相互關(guān)系檢索通過(guò)String Database基因/蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具，分析差異表達(dá)的蛋白之間的相互作用關(guān)系。見(jiàn)圖1。

±s,pg/ml)

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與機(jī)械通氣組比較，③P<0.05

圖1　蛋白芯片顯示差異表達(dá)蛋白相互作用

3討論

急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是致病和死亡的主要因素，嚴(yán)重影響患者的生存率。目前，治療急性肺損傷和ARDS的方法之一為機(jī)械通氣，但呼吸機(jī)的使用不當(dāng)反而導(dǎo)致肺損傷及炎癥反應(yīng)的加重[1]。ECMO技術(shù)將體內(nèi)靜脈血引流到體外，利用膜肺代替肺功能，氧合血液、排出二氧化碳，將靜脈血變?yōu)閯?dòng)脈血后再輸送回體內(nèi)，在一定程度上可以代替損傷的肺行使功能，以減輕肺的負(fù)擔(dān)，有利于肺功能的恢復(fù)，緩解機(jī)體缺氧狀態(tài)，減緩患者傷勢(shì)發(fā)展[2-5]。但是ECMO治療并不適合所有患者，有研究表明，ECMO技術(shù)對(duì)于提高急性肺損傷患者的生存率并沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。因此，研究ECMO治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的分子機(jī)制具有重要意義。

對(duì)于分子機(jī)制的研究，經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)只能對(duì)其中的一種或幾種蛋白進(jìn)行研究，而不能從蛋白整體水平上分析細(xì)胞或組織。蛋白質(zhì)組學(xué)是用于分析細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)整體定性定量的研究方法，使分析整體蛋白質(zhì)及其相互作用關(guān)系成為可能。另外，對(duì)于未知分子機(jī)制的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)分析也可以提供研究方向和靶點(diǎn)[6-8]。蛋白芯片技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有效技術(shù)之一，在本研究中，我們利用蛋白芯片技術(shù)分析篩選ECMO治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷可能的分子機(jī)制。蛋白芯片檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在20個(gè)細(xì)胞因子中，有15個(gè)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多項(xiàng)炎癥因子的差異表達(dá)表明，ECMO治療重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的可能分子機(jī)制是抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)為其深入研究提供多個(gè)指標(biāo)。通過(guò)String Data base基因/蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具分析15個(gè)差異表達(dá)的蛋白之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)多個(gè)蛋白之間形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這表明重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。

通過(guò)蛋白芯片技術(shù)初步篩選ECMO治療重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷過(guò)程中表達(dá)改變的蛋白因子，為研究其機(jī)制提供可能的研究方向，同時(shí)篩選可能的臨床檢測(cè)指標(biāo)。

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·體外膜肺氧合·

第一作者：佟昌慈(1988-)，女，遼寧撫順人，技師，碩士

Effect of extracorporeal membrane oxygenation on the expression of cytokines in acute lung injury induced by impact injury

TONG Chang-ci，LIU Yun-en，ZHANG Yu-biao，SHI Lin，LIU Ying，LIU Xue-lie，CONG Pei-fang，JIN Hong-xu，GAO Yan，HOU Ming-xiao(Department of Emergency Medicine,and Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the specific cytokines in the acute lung injury caused by severe trauma with the treatment of extracorporeal membrane oxygenation(ECMO).MethodsTwenty beagle dogs were randomly divided into 4 groups:normal control group,model group,mechanical ventilation treatment group,and ECMO treatment group.Rubber bullets hit to the canine model of lung injury.To extract total protein of the lung tissue,proteinchip assayed and screened differentially expressed cytokines.ResultsIn the detection of the 20 cytokines,compared with the control group,IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1,SCF,HGF and HGF R,IL-1B,MIP-1βand TNF RI B of model group,expressed increasingly,which decreased after mechanical ventilation and ECMO treatment,and the difference of ECMO treatment was more obvious.The expression tendency of VEGF,FGF-7 and IL-12p40 were opposite.The expression of GM-CSF,TNF alpha and IL-17A had no significant difference.EPO and IFNγhad no expression.ConclusionECMO treatment can improve the inflammatory response caused by severe trauma induced acute lung injury,and provide direction and target for the subsequent study of molecular mechanism of the acute lung injury caused by severe trauma with the treatment of ECMO.

Key words:Acute lung injury;Extracorporeal membrane oxygenation;Mechanical ventilation;Protein chip

收稿日期：2015-08-30

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.01.02

文章編號(hào)：2095-5561(2016)01-0006-04

中圖分類號(hào)：R563.9；R654.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

通信作者：侯明曉，E-mail:houmingxiao188@163.com

基金項(xiàng)目：2012年遼寧省科技攻關(guān)(201122007)；2012年全軍“十二五”面上項(xiàng)目(CSY12J002)；2013年全軍“十二五”面上延續(xù)項(xiàng)目(CSY13J003)