陳　軍，吳洪坤，李　暢，耿紅蓮，周　琳

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003)

?

·論著·

原發(fā)性肝癌患者血清腫瘤標(biāo)志物與腫瘤組織中凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)系

陳軍，吳洪坤，李暢，耿紅蓮，周琳△

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003)

摘要:目的探討原發(fā)性肝癌患者血清腫瘤標(biāo)志物與腫瘤組織中凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)系。方法40例原發(fā)性肝癌患者與40例健康者分別納入觀察組和對照組，檢測2組受試者的高爾基體蛋白73(GP73)、胸苷激酶(TK1)、Dickkopf1(DKK1)水平，以及腫瘤組織中凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。結(jié)果觀察組患者血清中GP73、TK1、DKK1水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝癌組織中凋亡抑制基因Plk1、Livin和Xiap的水平高于癌旁正常組織，促凋亡基因MTS1、Caspase-3、Caspase-8的水平低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血清GP73、TK1、DKK1水平與肝臟組織中Plk1、Livin、Xiap水平呈正相關(guān)，與MTS1、Caspase-3、Caspase-8的水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論原發(fā)性肝癌患者血清中GP73、TK1、DKK1水平異常升高，且與腫瘤組織中凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)密切相關(guān)，是判斷原發(fā)性肝癌病情的理想指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:原發(fā)性肝癌；腫瘤標(biāo)志物；凋亡

原發(fā)性肝癌是消化道系統(tǒng)常見惡性腫瘤，患者預(yù)后較差、生存率較低。在臨床實(shí)踐中，采取有效的輔助檢查手段早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，并準(zhǔn)確判斷病情有助于及時(shí)制定合理的治療方案。血清學(xué)指標(biāo)檢測是較為理想的無創(chuàng)性檢查方法，有利于長期監(jiān)測并動(dòng)態(tài)評估病情變化。高爾基體蛋白73(GP73)、胸苷激酶(TK1)、Dickkopf1(DKK1)等新型的腫瘤標(biāo)志物在原發(fā)性肝癌的篩查中具有較高的特異度[1-2],但其在腫瘤生長和存活中的作用尚不明確，本研究旨在明確肝癌患者血清中上述標(biāo)志物的變化情況，討論其與肝癌組織中凋亡基因和抗凋亡基因表達(dá)的關(guān)系，以此來探索血清腫瘤標(biāo)志物水平在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料2013年5月至2014年8月在本院消化科與感染科確診為原發(fā)性肝癌的40例患者納入觀察組，所有患者均參照原衛(wèi)生部醫(yī)政司組織，并由全國腫瘤防治辦公室與中國抗癌協(xié)會(huì)合編的《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》中有關(guān)原發(fā)性肝癌等腫瘤疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除有轉(zhuǎn)移病灶的患者；同期本院體檢中心的40例體檢健康者納入對照組，肝腎功能均正常。觀察組中男26例，女14例，平均(55.52±7.48)歲；對照組中男22例，女18例，平均(54.84±6.84)歲。2組受試者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，mRNA提取和檢測試劑盒購于日本Takara公司，酶標(biāo)儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.3檢測方法觀察組患者在入院后采集外周血5 mL，離心后取血清保存在-80 ℃環(huán)境下；術(shù)中操作時(shí)，取肝癌組織和癌旁正常組織，經(jīng)病理檢查確認(rèn)后，投入液氮冷凍并保存在-80 ℃環(huán)境下。對照組健康者在體檢時(shí)采集外周血5 mL，離心后取血清保存在-80 ℃。采用ELISA法在Bio-Rad酶標(biāo)儀上檢測血清中GP73、TK1、DKK1水平。取觀察組患者肝癌組織和癌旁正常組織約60 mg，加入Trizol裂解液1 mL抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分別擴(kuò)增Plk1、Livin、Xiap、MTS1、Caspase-3、Caspase-8。擴(kuò)增條件：變性95 ℃、15 s→特異性退火溫度、15 s→延伸72 ℃、25 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，引物序列見表1。通過軟件讀取循環(huán)閾值(Ct值)并計(jì)算mRNA水平相對值，兩組間比較時(shí)，設(shè)定癌旁正常組織中目的基因的mRNA水平為100，計(jì)算肝癌組織中目的基因的mRNA水平。

表1　　引物序列

2結(jié)果

2.12組受試者血清腫瘤標(biāo)志物的水平比較觀察組患者血清中GP73、TK1、DKK1水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.857、28.948、54.402，P<0.05)，見表2。

±s)

*：P<0.05,與對照組比較。

2.2凋亡抑制基因肝癌組織中凋亡抑制基因Plk1、Livin和Xiap的mRNA濃度高于癌旁正常組織中凋亡抑制基因mRNA濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3　　癌旁正常組織與肝癌組織中凋亡抑制基因

*：P<0.05,與癌旁正常組織比較。

表4　　癌旁正常組織與肝癌組織中促凋亡基因

*：P<0.05,與癌旁正常組織比較。

表5　　血清腫瘤標(biāo)志物與凋亡調(diào)節(jié)基因的相關(guān)分析

*：P<0.05,相關(guān)顯著。

2.3促凋亡基因肝癌組織中促凋亡基因MTS1、Caspase-3、Caspase-8的mRNA濃度低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.4血清腫瘤標(biāo)志物與凋亡調(diào)節(jié)基因的相關(guān)分析血清GP73、TK1、DKK1濃度與凋亡抑制基因Plk1、Livin和Xiap的mRNA濃度呈顯著正相關(guān)；與促凋亡基因MTS1、Caspase-3、Caspase-8的mRNA濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，見表5。

3討論

原發(fā)性肝癌的早期診斷與篩查一直是臨床研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，血清學(xué)指標(biāo)檢測是十分理想的輔助檢查方式，具有采樣操作方便、可以反復(fù)操作、結(jié)果穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。GP73、TK1、DKK1等是近年來新發(fā)現(xiàn)的對原發(fā)性肝癌具有診斷價(jià)值的血清腫瘤標(biāo)志物[1-2]。GP73是一類位于高爾基體順面的蛋白，在生理?xiàng)l件下處于細(xì)胞內(nèi)；在肝細(xì)胞發(fā)生癌變的過程中，GP73會(huì)由高爾基體進(jìn)入胞漿，而后在分泌小體的包裹下進(jìn)入血液循環(huán)[3]。TK1是一類存在于細(xì)胞質(zhì)中，且與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的蛋白，具體的作用是催化胸腺胞嘧啶脫氧核苷酸與磷酸脫氧核苷酸的互相轉(zhuǎn)化[4]。DKK1是一類分泌性糖蛋白，同樣與細(xì)胞增殖的調(diào)控密切相關(guān)，通過羧基末端的結(jié)構(gòu)域與LRP6結(jié)構(gòu)域互相作用來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)[5]。本研究通過分析原發(fā)性肝癌患者和健康者血清中腫瘤標(biāo)志物水平可知，觀察組患者血清中GP73、TK1、DKK1水平高于對照組。這就初步說明原發(fā)性肝癌患者血清中GP73、TK1、DKK1水平異常升高，對疾病具有診斷價(jià)值。

肝癌細(xì)胞的增殖過程同時(shí)受到了凋亡促進(jìn)基因和凋亡抑制基因的調(diào)控，Plk1、Livin、Xiap是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，Plk1屬于有絲分裂的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖的效應(yīng)[6-7]；Livin和Xiap均屬于凋亡抑制蛋白，能夠通過抑制凋亡分子Caspase來阻斷細(xì)胞的凋亡過程[8]。Caspase家族及Bax是效應(yīng)明確的促凋亡基因，Caspase家族中的Caspase-3和Caspase-8是凋亡過程的執(zhí)行分子，可以通過與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)原件的結(jié)合來直接造成細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-10]；Bax的促凋亡作用是通過與Bcl-2形成異源二聚體、抑制Bcl-2的促增殖作用來實(shí)現(xiàn)的，Bax表達(dá)缺失會(huì)造成細(xì)胞發(fā)生惡性增殖[11]。本研究通過熒光定量PCR的方法檢測了肝癌組織中凋亡相關(guān)基因的mRNA水平，結(jié)果顯示肝癌組織中凋亡抑制基因Plk1、Livin和Xiap的水平高于癌旁正常組織；促凋亡基因MTS1、Caspase-3、Caspase-8的水平低于癌旁正常組織。這就說明肝癌組織中存在凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)異常。

血清中腫瘤標(biāo)志物水平的升高與肝癌細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)，肝癌細(xì)胞的惡性增殖能力越強(qiáng)、腫瘤的惡性程度越高。在臨床實(shí)踐中，檢測肝癌細(xì)胞的惡性增殖能力有助于判斷腫瘤的惡性程度。但是，肝癌細(xì)胞增殖能力的檢查需要通過有創(chuàng)性的穿刺活檢來完成，不利于病情的長期監(jiān)測；并且在癌癥早期，調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的相關(guān)基因也不會(huì)出現(xiàn)明顯變化。相比穿刺活檢，血清學(xué)指標(biāo)檢測的優(yōu)勢在于創(chuàng)傷小、可重復(fù)，并且在癌癥發(fā)生的早期便會(huì)出現(xiàn)改變。如上所述，肝癌患者血清中GP73、TK1、DKK1水平異常升高。那么，上述血清學(xué)指標(biāo)能否反映肝癌細(xì)胞的增殖能力及疾病的惡性程度呢？為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，本研究對血清學(xué)指標(biāo)與凋亡調(diào)節(jié)基因的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示血清中GP73、TK1、DKK1水平與凋亡抑制基因的mRNA水平呈正相關(guān)；與促凋亡基因MTS1、Caspase-3、Caspase-8的mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。這就說明血清腫瘤標(biāo)志物可以反映腫瘤組織中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。

綜上所述，原發(fā)性肝癌患者血清中GP73、TK1、DKK1水平異常升高，且與腫瘤組織中凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)存在相關(guān)性，是判斷原發(fā)性肝癌病情的理想指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]王然，王曉東，李鳳煥，等．高爾基體蛋白GP73在肝癌診斷中的臨床意義[J]．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(13)：1572-1573．

[2]王強(qiáng)，謝躍文，夏潔．血清TK1、AFP、CEA聯(lián)合檢測在原發(fā)性肝癌診斷中的臨床價(jià)值[J]．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(9)：1101-1102．

[3]Jia Z,Wang L,Liu C,et al.Evaluation of α-fetoprotein-L3 and Golgi protein 73 detection in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Contemp Oncol (Pozn),2014,18(3):192-196.

[4]Faria M,Halquist MS,Kindt E,et al.Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for quantification of thymidine kinase activity in human serum by monitoring the conversion of 3′-deoxy-3′-fluorothymidine to 3′-deoxy-3′-fluorothymidine monophosphate[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2012,907(907):13-20.

[5]Huang Y,Yang X,Zhao F,et al.Overexpression of dickkopf-1 predicts poor prognosis for patients with hepatocellular carcinoma after orthotopic liver transplantation by promoting Cancer metastasis and recurrence[J].Med Oncol,2014,31(7):966.

[6]喻宏，賈曉敏，張燦，等．PLK1、CCL18在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(34)：48-52．

[7]Mok WC,Wasser S,Tan T,et al.Polo-like kinase 1,a new therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(27):3527-3536.

[8]何金花，陳順儀，王莉，等．Survivin、xiap、apollon和livin反義寡核苷酸對人消化系腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J]．中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(3)：367-372．

[9]譚湘芳，陳鵠，周俊，等．Livin和Caspase-3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及意義[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(5)：768-770．

[10]Luan Z,He Y,He F,et al.Rocaglamide overcomes tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand resistance in hepatocellular carcinoma cells by attenuating the inhibition of caspase-8 through cellular FLICE-like-inhibitory protein downregulation[J].Mol Med Rep,2015,11(1):203-211.

[11]Al-Fatlawi AA,Al-Fatlawi AA,Irshad M,et al.Rice bran phytic acid induced apoptosis through regulation of Bcl-2/Bax and p53 genes in HepG2 human hepatocellular carcinoma cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(8):3731-3736.

Relationship between serum tumor marker level with apoptosis regulation gene

expression of tumor tissue in patients with primary hepatocarcinoma

ChenJun,WuHongkun,LiChang,GengHonglian,ZhouLin△

(DepartmentofLaboratoryDiagnosis,AffiliatedChangzhengHospital,

SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relationship between serum tumor marker level and the apoptosis regulation gene of tumor tissue in the patients with primary hepatocarcinoma.Methods40 cases of primary hepatocarcinoma and 40 healthy people were included into the observation group and control group.Then the levels of tumor marker GP73,TK1,DKK1 in serum and the expression of apoptosis regulation gene in tumor tissue were detected in the two groups.ResultsThe serum GP73,TK1 and DKK1 levels of the observation group were significantly higher than those of the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).The apoptosis inhibiting gene Plk1,Livin and Xiap levels in the hepatocellular carcinoma tissue were higher than those in the adjacent normal tissues,while the pro-apoptotic gene MTS1,Caspase-3 and Caspase-8 levels were lower than those in the adjacent normal tissues,the difference had statistical significance(P<0.05);serum GP73,TK1 and DKK1 levels were positively correlated with Plk1,Livin and Xiap levels and negatively correlated with MTS1,Caspase-3 and Caspase-8 levels.ConclusionThe levels of serum GP73,TK1 and DKK1 in the patients with primary hepatocarcinoma are abnormally increased,moreover which are closely correlated with the apoptosis regulating gene expression and the ideal indexes to evaluate the disease condition of primary hepatocarcinoma.

Key words:primary hepatocarcinoma;tumor marker;apoptosis

(收稿日期：2015-09-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.007

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0305-03

作者簡介：陳軍，男，檢驗(yàn)主管技師，主要從事生物化學(xué)及LIS管理研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:lynnzhou36@163.com。