何 進， 李 平*， 謝體波， 黨 娟， 吳紫潔， 何方洋，2

(1.貴州勤邦食品安全科學技術(shù)有限公司， 貴州 貴陽 550009； 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司， 北京 100012)

化學發(fā)光微粒子免疫法檢測肉制品中的磺胺類藥物殘留

何 進1， 李 平1*， 謝體波1， 黨 娟1， 吳紫潔1， 何方洋1，2

(1.貴州勤邦食品安全科學技術(shù)有限公司， 貴州 貴陽 550009； 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司， 北京 100012)

為快速、簡便地檢測到肉制品中的磺胺類藥物殘留，采用化學發(fā)光微粒子免疫法對雞肉、魚肉、蝦肉中的磺胺類藥物殘留進行檢測，并與儀器法測量結(jié)果進行比較。結(jié)果表明：化學發(fā)光微粒子免疫法的靈敏度為1 μg/kg，3類樣品的最低檢測限均為0.864 μg/kg。磺胺類藥物的添加回收率在94.33%～104.28%，RSD在1.2%～6.5%；檢測結(jié)果與儀器法一致，且具有成本低、檢測快、檢測批量大等優(yōu)點，適用于肉制品中磺胺類藥物的殘留檢測。

化學發(fā)光試劑盒； 磺胺； 肉制品； 殘留檢測

磺胺類藥物(Sulfonamides，SA)是具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，其抗菌譜較廣，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌以及陰性菌有抑制作用，具有性質(zhì)穩(wěn)定，品種多、價格低和使用簡便等特點，被廣泛應用于獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑或動物疾病治療藥物[1]。但是人類經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動物性食品可引起磺胺類藥物在體內(nèi)逐漸累積。其危害性主要表現(xiàn)為細菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌及激素樣作用等[2-3]。隨著社會的發(fā)展，磺胺類藥物的不合理使用，使其在動物性食品中殘留引起生態(tài)環(huán)境污染和危害人類健康的潛在威脅備受關(guān)注，成為人類亟待解決的問題之一，而各類檢測方法也隨之應運而生。

目前，磺胺類藥物的檢測方法主要有微生物學法、理化分析方法和免疫法等。微生物法因操作費時且靈敏度、特異性都較差，在定性定量上存在困難，不能滿足現(xiàn)代殘留檢測的需要而未得到廣泛應用[4]。理化法常作為確證方法檢測動物組織中磺胺類藥物的殘留，主要有液相色譜法(HPLC)[5-7]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)[8-10]等，此法雖準確、靈敏、高效，但前處理過程較繁瑣，儀器較昂貴，且需專業(yè)人員來操作，故其應用也受到一定限制[11]。免疫分析法主要為酶聯(lián)免疫法與化學發(fā)光微粒子免疫分析法，該法靈敏度高、操作簡單、檢測成本低、可批量檢測，具有較好的發(fā)展前景[12]。為尋求快速、簡便地檢測到肉制品中的磺胺類殘留物質(zhì)，采用化學發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)對肉制品中的磺胺類物質(zhì)進行測定，以保障消費者免受肉制品中磺胺類藥物殘留的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

磺胺化學發(fā)光微粒子免疫分析測定試劑盒(貴州勤邦生物科學技術(shù)有限公司)，磺胺類藥物標準品：純度>99.5%(美國Sigma公司),氫氧化鈉(滄州眾信化工有限公司),乙腈(美國spectrum公司),乙酸乙酯(蘇州德榮化工)。

儀器：磁免疫全自動化學發(fā)光檢測儀(德國拜耳公司)，氮吹儀(DSY-111，上海喬躍電子科技有限公司)渦旋儀(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，均質(zhì)器(CJ-04，上海丙林電子科技有限公司)，離心機(GT16—3A，北京時代北利離心機有限公司)。電子天平(AL-204，沈陽龍騰電子科技有限公司)，微量移液管(單道20～200 μL，100～1 000 μL，美國Thermo公司)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 樣品前處理

雞肉、魚肉和蝦肉，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取(2.0±0.05)g樣本于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入3.8 mL乙腈-NaOH(0.1 mol/L)溶液，再加入2 mL乙酸乙酯，渦動混勻，室溫(20～25℃)3 000 r/min離心5 min；移取3 mL上層有機相至10 mL潔凈干燥玻璃管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL正己烷，用渦旋儀渦動1 min，再加1 mL復溶工作液，用渦旋儀渦動1 min，室溫(20～25℃)3 000 r/min，離心5 min；除去上層有機相，取下層水相用于分析。

1.3 磺胺類藥物的測定

取出試劑盒內(nèi)微孔板，將標準品和樣品對應微孔空編號，每個標準品和樣品做3孔平行，記錄樣品孔和標準孔位置。各微孔中分別加50 μL標準品或樣品、50 μL酶標抗體和50 μL磁標抗體工作液，混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光反應30 min。揭開蓋板膜，甩干孔內(nèi)液體，按250 μL/孔加入洗滌工作液，每10 s洗滌1次，充分洗滌4～5次，用吸水紙拍干。分別按50 μL/孔加入底物A液和B液，混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光反應；15 min后按50 μL/孔加入終止液，混勻，設定反應杯于450 nm處且在5 min內(nèi)測完OD值，并記錄。

1.3.1 磺胺類藥物濃度的計算 分別對0 μg/L、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L和81 μg/L系列濃度的標準溶液進行CMIA檢測，測定RLU值。以磺胺類藥物濃度對數(shù)值(Log)為橫坐標，各對應濃度的抑制率(RLU/RLU)為縱坐標，制作標準曲線。

1.3.3 精密度的測定 精密度又稱可重復性，反映測定方法對某一特定樣品多次測定所得結(jié)果的重復程度，這是評定化學發(fā)光試劑盒質(zhì)量最基本的參數(shù)，常用變異系數(shù)表示。在檢測為陰性的雞肉樣本中添加2 μg/L磺胺類藥物，做6個平行，用試劑盒提供的操作方法提取測定，計算測定樣品的變異系數(shù)。

1.3.4 樣品添加回收試驗 取空白雞肉、魚肉、蝦肉樣品以1 μg/L、2 μg/L和4 μg/L磺胺類藥物進行添加，每種樣品、每個濃度各5個平行。

1.3.5 儀器對比試驗 隨機采購雞肉、魚肉、蝦肉樣本各20份，分別用CMIA法和HPLC-MS/MS進行檢測。儀器方法參考國標GB/T 21316—2007[14]。

1.4 結(jié)果計算

百分吸光率=B/B0×100%，式中，B為標準品或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0 μg/kg標準溶液的平均吸光度值。

將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品所對應濃度，乘以其對應稀釋倍數(shù)即為樣品中磺胺類試劑的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的建立

由圖示可知，標準曲線方程為y=-40.45x+77，R2=0.993，其中磺胺類藥物的IC50值為4.0 μg/L，說明磺胺類藥物試劑盒的線性關(guān)系良好，可以滿足殘留分析的要求。

2.2 試劑盒的檢測限及精密度

檢測限：由表1可知，化學發(fā)光微粒子免疫法測定20次空白雞肉磺胺類藥物的平均值為0.303 μg/kg，標準差為0.187 μg/kg，最低檢測限為0.864 μg/kg。

精密度：通過測定，磺胺類藥物測定試劑盒的變異系數(shù)分別為2.36%、1.96%、2.54%、4.32%、3.11%、2.08%、3.68%、4.21%、2.87%、1.19%，均小于10%，說明該試劑盒重現(xiàn)性好，性能較為穩(wěn)定，具有較好的精密度。

圖示 磺胺類藥物化學發(fā)光試劑盒標準曲線

Table 1 Detection results of 20 blank chicken samples of sulfonamides μg/kg

表2 化學發(fā)光微粒子免疫法測定3種肉制品中磺胺類 藥物的試劑盒添加回收率

Table 2 Addition recovery of 3 meat products of SA kit by CMIA

樣品名Nameofsamples添加濃度/(μg/L)Additionconcentration平均回收率/%AveragerecoveryRSD/%雞肉1．0100．115．4 Chicken2．095．946．54．094．361．2魚肉1．0105．143．1 Fishflesh2．097．774．24．096．583．6蝦肉1．096．582．1 Shrimp2．0104．282．54．094．333．7

表3 CMIA與HPLC-MS/MS法測定肉制品中 磺胺類物質(zhì)的結(jié)果

Table 3 Detection of sulfonamides in meat products by CMIA and HPLC-MS/MS

樣本Samples樣本號SamplenumberCMIAHPLC?MS/MS樣本號CMIAHPLC?MS/MS雞肉1--11-- Chicken2241．123512--3--13--4--14--5--15--6--16147．5144．77--17--8--18--9--19--10--20--魚肉1--11-- Fishflesh2--12145．9140．53--13--4--14--5--15--6214．8210．51682．4807--17--8--18--9--19--10--20--蝦肉1--11-- Shrimp2--12--395．190．513--4--14--5--15167．5164．86--16--7--17--887．485．918--9--19--10--20--

注：-表示未檢出

Note:-,Non-detected

2.3 樣品添加回收率

由表2可知，磺胺類藥物在雞肉、魚肉、蝦肉中的添加回收率在94.33%～105.14%，RSD在1.2%～6.5%，表明化學發(fā)光微粒子免疫法測定磺胺類藥物的添加回收率符合我國獸藥殘留標準[13]。

2.4 CMIA與HPLC-MS/MS法的測定結(jié)果

由表3可知，CMIA法與儀器法測定結(jié)果一致，吻合度達到100%，說明該方法準確，適用于雞肉、魚肉、蝦肉中磺胺類藥物的殘留檢測。3種基質(zhì)共60份樣品中，檢出限超過國標(50 μg/kg)的共16份，檢出率為25%，表明我國磺胺類藥物在動物性組織中的殘留存在超標情況，雖不嚴重，但應引起相關(guān)職能部門的注意，做到防患于未然。

3 結(jié)論

試驗采用化學發(fā)光微粒子免疫分析法對雞肉、魚肉、蝦肉中的磺胺類藥物殘留進行檢測，方法靈敏度為1 μg/kg，3類樣品的最低檢測限均為0.864 μg/kg。磺胺類藥物在雞肉中添加回收率為94.36%～100.11%，RSD為1.2%～6.5%；魚肉中磺胺類藥物添加回收率為96.58%～105.14%，RSD為3.1%～4.2%；蝦肉中磺胺類藥物的添加回收率為94.33%～104.28%，RSD為2.1%～3.7%。與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相比，檢測結(jié)果一致，但檢測時間短、前處理簡單、成本低、批次檢測量大，適用于雞肉、魚肉和蝦肉等肉制品中磺胺類藥物的大批量快速檢測。

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(責任編輯： 孫小嵐)

Detection of Sulfonamides Residues in Meat Products by CMIA

HE Jin1, LI Ping1*, XIE Tibo1, DANG Juan1, WU Zhijie1, HE Fangyang1，2

(1.GuizhouKwinbonFoodSafetyScience&TechnologyCo.,Ltd.,Guiyang,Guizhou550009; 2.BeijingKwinbonFoodSafetyScience&TechnologyCo.,Ltd.,Beijing100012,China)

The sulfonamides residues in chicken, fish flesh and shrimp were detected by CMIA and HPLC-MS/MS respectively to rapidly and easily detect sulfonamides in meat products and guarantee consumers’ personal rights. Results:The sensitivity of CMIA is 1 μg/kg and the lowest detectable limit of chicken, fish flesh and shrimp all is 0.864 μg/kg. The addition recovery of SA is 94.33%～104.28% andRSDis 1.2%～6.5%, which is consistent with that of HPLC-MS/MS. CMIA with the advantages of low cost, rapid detection, large batch popularization potential can be suitably used in SA residue detection in meat products.

chemiluminescent kit; sulfonamides; meat product; residue detection

2016-01-11； 2016-05-04修回

2013創(chuàng)新人才計劃項目“全自動化學發(fā)光免疫分析食品安全快速檢測系統(tǒng)研發(fā)”[筑科合同(2013)209-01]；2014貴州省科技成果轉(zhuǎn)化引導基金計劃項目“動物源性食品中獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化及推廣應用”[黔科合成轉(zhuǎn)字(2014)5104]；2015貴州省科技計劃項目“農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)集成研究與應用示范”[黔科合NY(2015)3016-1]

何 進(1988-)，女，工程師，從事食品安全快速檢測技術(shù)的研究與開發(fā)。E-mail: 245208083@qq.com

*通訊作者：李 平(1986-)，女，工程師，碩士，從事食品安全快速檢測技術(shù)的研究與開發(fā)。E-mail：294173456@qq.com

1001-3601(2016)05-0225-0148-04

S851.34+7

A