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廣西地區(qū)漢族人群PRKCB1基因-546C/G多態(tài)性與糖尿病腎病易感性相關(guān)性研究

李軼春1,岑文新2,肖玲3

(廣西壯族自治區(qū)北海市中醫(yī)醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.腎內(nèi)科;3.糖尿病?？?，廣西 北海536000)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus, DM)微血管并發(fā)癥之一，在2型糖尿病患者中，其致殘、致死率僅次于大血管并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，病程超過25年以上的糖尿病腎病累積患病率高達(dá)25%-40%，也是我國導(dǎo)致終末腎功能衰竭的第2位病因[1]。其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，可能與環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)。蛋白激酶Cβ(PKC-β)是細(xì)胞內(nèi)信號傳遞關(guān)鍵分子之一，激活后通過改變腎臟血流動力學(xué)、增厚腎小球毛細(xì)管基底和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚、加大血管炎癥反應(yīng)、增加血管通透性等方式參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展[2][3]，因此蛋白激酶Cβ(PKC-β)基因PRKCB1基因可能是誘發(fā)DN的相關(guān)基因。本文選擇120例廣西漢族人群為研究對象，對PRKCB1基因啟動子-546C/G基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較分析，旨在探討廣西漢族人群PRKCB1基因-546C/G多態(tài)性分布、及與糖尿病病腎病易感性相關(guān)性。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2012年1月-2013年5月在廣西北海中醫(yī)院內(nèi)分泌科、腎內(nèi)科2型糖尿病患者，均為漢族人。彼此此無血緣關(guān)系。均符合2010年《中國2型糖尿病防治指南》[4]診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)尿微量白蛋白排泄率(UARE)分為糖尿病非腎病組(NDN)42例、糖尿病腎病組(DN)38例。同期選擇健康體檢人群43例。排除血糖控制不穩(wěn)定、心肺功能不全、腎功能不全、1個(gè)月內(nèi)服用影響尿蛋白排泄藥物者。

1.2方法

1.2.1生物指標(biāo)檢測所有研究對象均于清晨8：00抽取靜脈血6 ml，分裝于普通試管和乙二胺乙酸EDTA抗凝試管中，一份送特殊化室檢測，另一份于25 cm、3 000 r/min離心15 min，取血細(xì)胞部分存于是-70℃冰箱中待檢，同時(shí)檢測尿液中尿白蛋白排泄率。

1.2.2基因組DNA提取取出置于-70℃冰箱血細(xì)胞，常溫解凍，利用MassARRAY Assay(質(zhì)譜陣列)高通量檢測平臺進(jìn)行檢測分析，PCR引物參考基因庫PRKCB1進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工合成，片段長度150 bp，上游引物：5’-AGGCAAGCAAAGCCAAGA-3’；下游引物：‘’-GCTCCCGCTGTCACTCATT-3’。反應(yīng)體系：10XPCR Buffer5.0 μl，dNTPmix4.0 μl,DNA模板2.5 μl，上游引物1.0 μl，下游引物1.0 μl，Pfu酶0.4 μl，滅菌三蒸水36.1 μl；反應(yīng)條件：97℃預(yù)變性5 min，97℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl與150 bp DNA Ladder Marker加樣于2%瓊脂糖凝膠上，80V恒壓電泳30 min，在紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物和150 bp Marker遷移率相同，則可判定為所需片段(見圖1)，余PCR產(chǎn)物采用DNA Extraction Kit純化。

圖1　PCR擴(kuò)增PRKCB1-546產(chǎn)物位點(diǎn)電泳圖

1.3數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果

2.13組病例臨床、生化指標(biāo)比較

3組病例性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NDN組與DN組FBG、PBG、TG、HbA1c、Bun明顯高于對照組；DN組PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER明顯高于NDN組；HDL-C、LDL-C明顯低于NDN組，見表1。

表1　3組病例臨床、生化指標(biāo)比較

備注：與正常對照組比較，*P<0.05；ND組與NDN組比較，#P<0.05。FBG：空腹血糖；PBG：餐后2 h血糖；TC：總膽固醇；TG：甘油三脂；HbAlc：糖化血紅蛋白；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；Bun：尿素氮；Cr：肌酐；LnUAER：尿微量白蛋白排泄量的自然對數(shù)。

2.23組病例基因型與基因頻率比較

3組間PRKCB1基因-546均存在CC、CG、GG 3種基因型和C、G兩種等位基因，均符合Hardy-Weinberg平衡，提示樣本具有群體代表性。NDN組與正常對照組基因型和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DN組CC基因型、C等位基因頻率明顯低于正常對照組、NDN組(χ2=6.125、5.642，P<0.05)；DN組GG基因型、G等位基因頻率顯著高于正常對照組、NDN組(χ2=9.364、11.684，P<0.01)，見表2。

表2　3組病例基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

2.3糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)因素回歸分析

以DN患者與否為因變量，以性別、FBG、PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER、HDL-C、LDL-C、PRKCB1為自變量進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果表明，PRKCB1-546GG基因型患者發(fā)生DN風(fēng)險(xiǎn)為CC基因型患者3.568倍，CG基因型發(fā)生DN風(fēng)險(xiǎn)為CC基因型1.882倍，TC、HbA1c也共同影響DN的發(fā)生發(fā)展，見表3。

表3　糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

3討論

蛋白激酶C(PKC-β)分子量為67-83KD，屬于絲氨酸激酶家庭中的一員，均為單鏈多肽，PRKCB1基因編碼PKC-βⅠ、PKC-βⅡ定位于16p11.2，全長375 kb，目前已知有9個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，-546C/G 單核苷酸多態(tài)性是6個(gè)位于啟動子之一[5]。美國學(xué)者[6]研究報(bào)道，對于病程<24年的糖尿病患者，PRKCB1基因啟動子-546C/G攜帶G等位基因誘發(fā)糖尿病腎病的危險(xiǎn)性更大(95%CI：1.37-4.38)；日本學(xué)者[7]通過長達(dá)6年的前瞻性研究報(bào)道，在正常蛋白尿及微量白蛋白尿2型糖尿病患者中，PRKCB1基因啟動子-546C/G攜帶G等位基因患者eGFR下降速度更加明顯(-2.96±0.62 VS -1.63±0.15)ml/min，且更易進(jìn)展到終末期腎病，因此提出PRKCB1基因多態(tài)性作為日本2型糖尿病腎病患者進(jìn)展的預(yù)測指標(biāo)。從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料分析，我國目前鮮見，PRKCB1基因啟動子-546基因多態(tài)性與糖尿病腎病的相關(guān)性研究，這也是本課題研究的出發(fā)點(diǎn)。

本文研究中，3組間PRKCB1基因-546均存在CC、CG、GG 3種基因型和C、G兩種等位基因，其分布均符合Hardy-Weinberg平衡，提示樣本具有群體代表性。DN組CC基因分布明顯低于正常對照組、NDN組，G等位基因頻率顯著高于正常對照組、NDN組，且正常對照組與糖尿病非腎病組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PRKCB1基因多態(tài)性與糖尿病無關(guān)，而與糖尿病腎病相關(guān)，也提示G等位基因是糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素，C等位基因是糖尿病腎病的保護(hù)因素。國外學(xué)者分析-546C/G SNP可能影響到PRKCB1的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因素在糖尿病狀態(tài)下參與了糖尿病腎病并發(fā)平的發(fā)生[8,9]。通過以性別、FBG、PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER、HDL-C、LDL-C、PRKCB1為自變量進(jìn)行多因素回歸分析研究表明，PRKCB1-546GG、CG基因型患者發(fā)生DN風(fēng)險(xiǎn)為CC基因型患者3.568、1.882倍，進(jìn)一步證實(shí)了PRKCB1-546GG、CG基因是2型糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素。研究同時(shí)表明，TC、HbA1c也共同影響DN的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)外學(xué)者不同的研究結(jié)果也均表明控制血糖能夠降低糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生[10,11]。

綜上所述，廣西漢族人群PRKCB1基因啟動子-546位存在CC、CG、GG基因型和C、G等位基因，CG型基因、G等位基因?yàn)樘悄虿∧I病的危險(xiǎn)因素，CC型基因、C等位基因?yàn)樘悄虿∧I病的保護(hù)因素。

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(收稿日期：2015-01-09)

文章編號：1007-4287(2016)01-0094-03 1007-4287(2016)01-0097-02

基金項(xiàng)目：編號：201206003;北海市科技局