湛潔誼，盧慧敏，林穗玲

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，廣東 廣州510120；2.廣州天河區(qū)婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510610)

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哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的測(cè)定及臨床意義

湛潔誼1，盧慧敏1，林穗玲2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，廣東 廣州510120；2.廣州天河區(qū)婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510610)

摘要：目的探討CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘兒童外周血中的比例改變，并探討其臨床意義。方法150例哮喘患兒按臨床表現(xiàn)分為急性發(fā)作組(50例)、臨床緩解期組(50例)和咳嗽變異性哮喘組(50例)，另選擇50名健康兒童為正常對(duì)照組。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述各組外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。結(jié)果急性發(fā)作期組患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平較緩解組、咳嗽變異性哮喘組及健康對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，而緩解期組及咳嗽變異性哮喘組與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了哮喘的發(fā)生與發(fā)展，哮喘的嚴(yán)重程度可能與CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平相關(guān)。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0078)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是一類(lèi)調(diào)節(jié)或抑制其他免疫細(xì)胞功能的細(xì)胞。近年來(lái)，研究資料顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中可能起著重要作用。在過(guò)去的研究中，多數(shù)以CD25+來(lái)界定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，但這樣得到的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能會(huì)不完整，因?yàn)榻?jīng)免疫激活的效應(yīng)性T細(xì)胞CD25的表達(dá)也會(huì)上調(diào)，導(dǎo)致較難區(qū)分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞。近期研究提示CD127的低表達(dá)(CD4+CD25nt/hiCD127loTreg)能較好地反映完整的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。目前關(guān)于CD4+CD25nt/hiCD127loTreg與哮喘的研究不多，特別是未見(jiàn)咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的研究。該文通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)期及不同類(lèi)型哮喘患者外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的表達(dá)水平，探討該細(xì)胞表達(dá)水平與哮喘發(fā)病的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2010-2013年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科門(mén)診哮喘患者150例，均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的哮喘及其分期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。急性發(fā)作期哮喘患兒50例，年齡2-9歲；臨床緩解期哮喘患兒50例，年齡2.5-11歲；咳嗽變異性哮喘患兒50例，年齡3-10歲。對(duì)照組50例，為廣州市天河區(qū)婦幼保健院健康體檢兒童，年齡2-10歲，均無(wú)自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病以及腫瘤疾病史，近2個(gè)月內(nèi)無(wú)感染性疾病，并除外近3個(gè)月內(nèi)使用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或其他免疫調(diào)節(jié)劑史。各組的性別構(gòu)成、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人的CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluro647及同型對(duì)照單抗，F(xiàn)AC lysing solution溶血素，流式細(xì)胞儀FACScanto，以上試劑及儀器均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。分析軟件為FACSDiva software。

1.3外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的檢測(cè)抽取研究對(duì)象外周靜脈血2 ml，用EDTA抗凝。取兩支流式上樣管，分別加入EDTA抗凝全血50 μl，第一管加同型對(duì)照，第二管加CD4FITC、CD25PE、CD127 Alexa Fluro647，各為10 μl，室溫避光孵育15-20分鐘，然后加入FASC 溶血素1 ml，混合后避光靜置10分鐘，1 000 r/min離心3分鐘，加入2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，加入適量PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以CD4陽(yáng)性細(xì)胞設(shè)門(mén)，分析CD4+CD25nt/hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。

2結(jié)果

2.1研究對(duì)象年齡、性別構(gòu)成比較見(jiàn)表1。

表1　不同組別年齡及性別構(gòu)成比較

2.2不同組別外周血中CD4+CD25nt/hiCD127loTreg占CD4+T細(xì)胞的比例比較急性發(fā)作期哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg占CD4+T細(xì)胞的比例明顯低于健康對(duì)照兒童、臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒(P<0.05)。臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒與健康對(duì)照兒童比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。臨床緩解期哮喘患兒與咳嗽變異性哮喘患兒比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2　不同組別外周血中CD4+CD25nt/hiCD127loTreg

注：*與急性發(fā)作組比較，P<0.05。

3討論

CD4+CD25+Treg是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)小的細(xì)胞亞型，具有免疫無(wú)能性和抑制性?xún)纱蠊δ芴卣鱗2]。近年來(lái)，研究資料顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中可能起著重要作用。在過(guò)去的研究中，多數(shù)界定CD4+CD25+T細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，但這樣得到的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞有部分重疊，較難區(qū)分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞[3]。根據(jù)CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD25的程度不同，CD4+CD25+Treg可分為CD4+CD25hiTreg、CD4+CD25ntTreg(中等強(qiáng)度表達(dá))和CD4+CD25-Treg。但具有免疫調(diào)節(jié)或抑制活性的細(xì)胞主要是中、高表達(dá)CD25+的CD4+T細(xì)胞(CD4+CD25nt/hiTreg)[4，5]。但由于對(duì)CD25nt/hh細(xì)胞設(shè)門(mén)具有主觀性，使得結(jié)果難以掌握。因此CD25nt/hi表型可能會(huì)低估或高估調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。近來(lái)認(rèn)為叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead/winged helix transcription factor 3，F(xiàn)oxp3)是CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化發(fā)育和功能維持的重要調(diào)控基因[6]。Foxp3主要表達(dá)于CD4+CD25highTreg，達(dá)97%左右[7]。Foxp3被認(rèn)為是CD4+CD25+Treg的特異性標(biāo)志物[8-11]。但由于FOXP3為核內(nèi)蛋白，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜，操作步驟繁瑣，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中影響因素較多[12]，因而限制了其臨床應(yīng)用。最新研究表明CD127的低表達(dá)(CD4+CD25nt/hiCD127lo)與CD25中高表達(dá)Foxp3有良好的相關(guān)性[13，14]。細(xì)胞膜表面抗原CD127是IL-7受體的一部分。CD127在效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和記憶T淋巴細(xì)胞活化后仍能持續(xù)表達(dá)，只在調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)下降，因此聯(lián)合應(yīng)用CD25中高表達(dá)和CD127低表達(dá)，能夠有效去除CD25+T淋巴細(xì)胞中效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而反映調(diào)節(jié)型T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。由于CD127為表面抗原，無(wú)需對(duì)胞內(nèi)進(jìn)行染色，操作較簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，且可保持細(xì)胞的完整性，使染色后的細(xì)胞仍可以進(jìn)行培養(yǎng)等進(jìn)一步的研究。所以CD4+CD25nt/hiCD127loTreg是識(shí)別調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)記。

該實(shí)驗(yàn)研究表明，哮喘急性發(fā)作期患兒的外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平明顯低于臨床緩解期哮喘患兒、咳嗽變異性哮喘患兒和正常對(duì)照組兒童，與上官文姬[15]的報(bào)道一致，提示哮喘急性發(fā)作期患兒體內(nèi)存在T調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能平衡失調(diào)，導(dǎo)致抑制免疫功能減弱或呈低反應(yīng)性，可能是引起支氣管哮喘發(fā)病的機(jī)制之一。而臨床緩解期哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與上官文姬[16]的報(bào)道不一致，分歧的產(chǎn)生可能與疾病的狀態(tài)不同有關(guān)，哮喘患兒癥狀緩解可能與體內(nèi)CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的水平恢復(fù)有關(guān)。同時(shí)咳嗽變異性哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平與正常對(duì)照組比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與咳嗽變異性哮喘患兒的病情較輕，CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平下降不明顯有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)研究表明哮喘的嚴(yán)重程度可能與CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平相關(guān)。目前尚未見(jiàn)咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平關(guān)系的研究報(bào)道，尚需更大量的樣本驗(yàn)證及進(jìn)一步的研究。

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關(guān)鍵詞：哮喘；兒童；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

The level of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells and its clinical significance in children with asthmaZHANJie-yi,LUHui-min，LINSuiling.(DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniviersity,Guangdong510120,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the proportion change of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells(Treg)in peripheral blood of children withasthma and to analyze its significance.Methods150 asthmatic children were divided into three groups according to their clinicalfeatures：50 subjects in acute asthma attack group,50 subjects in clinical remission of asthma group and 50 subjects in cough variant asthma group，meanwhile,50 healthy children were enrolled in the control group.The levels of CD4+CD25nt/hiCD127loTreg in peripheral blood of all children were detected by flow cytometer.ResultsThe CD4+CD25nt/hiCD127loTreg level in acute attack group were lowest of the four groups (P<0.05),but the level in the control group was not significantly dif-ferent from the the clinical remission group and the cough variant asthma(allP>0.05).ConclusionThe CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells may be involved in the pathogenesis of asthma,The level of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells correlated with the severity of asthma in children.

Key words:Asthma；Children；Regulatory T cell；Flow cytometry

(收稿日期：2014-11-20)

作者簡(jiǎn)介：湛潔誼(1967-)，女，廣東，畢業(yè)于廣州醫(yī)學(xué)院，本科學(xué)歷，碩士學(xué)位，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閮和粑到y(tǒng)疾病。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R562.2+5

文章編號(hào)：1007-4287(2016)01-0078-03

基金項(xiàng)目：廣東省衛(wèi)生廳立項(xiàng)課題(A2011253)