?

蛋白激酶C-δ特異性脫氧核酶對HepG2細(xì)胞生長的影響

魏卓1，羅速2*

(1.吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春130021；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013)

蛋白激酶C(PKC)存在于細(xì)胞漿內(nèi)，是一類由鈣激活的磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與神經(jīng)傳導(dǎo)、腫瘤生長及細(xì)胞生長、分化和凋亡等生理病理過程密切相關(guān)。依據(jù)對二?；视?DAG)和Ca2+的依賴不同，PKC可以分為傳統(tǒng)型(cPKC)、新型PKC(nPKC)和非典型PKC(aPKC)[1-3]三類。蛋白激酶C-δ(PKC-δ)屬于nPKC，其激活物是DAG而并非是Ca2+；PKC-δ被激活后可轉(zhuǎn)移至線粒體或細(xì)胞膜上，活化并切割半胱天冬酶3(caspase-3)后釋放出活性片段，進而使多種底物蛋白磷酸化，使其活化或者失活從而引起細(xì)胞凋亡[3-8]。PKC-δ對細(xì)胞凋亡的調(diào)控具有促凋亡和抗凋亡的雙重性。因此，PKC-δ的異常表達或者激活與多種生命現(xiàn)象密切相關(guān)，尤其是對腫瘤細(xì)胞的凋亡有著非常重要的意義[9]。

脫氧核酶(deoxyribozymes,DRz)是一種新型的基因治療方法，尤其是10-23型DNAzyme，幾乎可以特異性地結(jié)合任何靶向RNA[10]，切割位點序列要求非常簡單，即嘌呤-嘧啶結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定[11-16]。10-23型脫氧核酶結(jié)構(gòu)包括底物結(jié)合臂和催化序列兩部分，其活性中心由15個脫氧核糖核酸組成，活性中心兩側(cè)各有約7-9個核苷酸的底物結(jié)合臂，底物結(jié)合臂通過Watson2 Crick配對與底物結(jié)合后進行底物的定點切割[17-20]。實驗設(shè)計了針對PKC-δ mRNA的10-23DNAzyme，并對其兩端進行硫代化修飾，利用RT-PCR方法擴增PKC-δ的cDNA片段后，將其克隆到pcDNA3.1(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選陽性重組質(zhì)粒后使用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得PKC-δ mRNA表達載體，MTT法檢測DRz,DRz-s,和asON 對HepG2.2.15 細(xì)胞的生長影響。

1材料與方法

1.1材料

HepG2.2.15肝癌細(xì)胞由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供，JM109感受態(tài)細(xì)胞。T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自provmega，USA；RT-PCR 試劑盒、MTT試劑、DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒等試劑均購自大連寶生物公司。 MEM培養(yǎng)基是Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1PKC-δ mRNA表達載體的構(gòu)建HepG2.2.15肝癌細(xì)胞以含10%胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM(Invitrogen,USA)培養(yǎng)液于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱(Nuaire,USA)中培養(yǎng)。Trizol法(Invitrogen,USA)提取細(xì)胞中的總RNA，RT-PCR擴增PKC-δ基因，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠，于凝膠成像系統(tǒng)中分析、保存圖像后將產(chǎn)物純化并鑒定。用primer5.0軟件設(shè)計由上海生工合成表1引物，上游和下游分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。

表1　引物基因序列

將RT-PCR擴增出的PKC-δ cDNA片段，經(jīng)雙酶切后定向克隆入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的多克隆區(qū)T7啟動子的下游。EcoRⅠ單酶切線性化PKC-δ重組質(zhì)粒，T7RNA聚合酶以T7為啟動子、以線性化PKC-δ重組質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄出PKC-δ單鏈RNA(Invitrogen)。

1.2.2無細(xì)胞切割體系DRz對PKC-δ mRNA的催化切割效應(yīng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染DRz、DRz-s、asON由上海生工合成，達到PAGE級純化標(biāo)準(zhǔn)?；蛐蛄腥绫?所示。

表2　PKC-δ特異性脫氧核酶基因序列

下劃線部分為10-23型脫氧核酶的活性中心。

PKC-δ mRNA和脫氧核酶酶切反應(yīng)后，7M尿素10%變性聚丙烯酰胺凝膠，凝膠成像系統(tǒng)觀察、保存、分析圖像。取生長狀態(tài)好、處于對數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，進行DRz 、DRz-s、asON轉(zhuǎn)染，提取總RNA，RT-PCR半定量檢測HepG2.2.15細(xì)胞中PKC-δmRNA表達水平。MTT法觀察脫氧核酶對HepG2.2.15細(xì)胞的生長影響，96孔板上方為空白調(diào)零，設(shè)立陰性對照、轉(zhuǎn)染試劑對照、DRz、DRz-s、asON，共6組，每組10個孔。

2結(jié)果

2.1PKC-δ mRNA表達載體檢測

總RNA的質(zhì)量直接關(guān)系到RT-PCR實驗結(jié)果，實驗提取的總RNA的結(jié)果顯示如圖1(A)所示，光密度比值A(chǔ)260/280達1.814；瓊脂糖凝膠電泳28S、18S、5S條帶清晰，因此可作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實驗設(shè)計引物獲得成功，實驗結(jié)果清晰可見，PKC-δ的RT-PCR電泳結(jié)果如圖1(B)所示。PKC-δ cDNA片段大小為228 bp，條帶大小正確，無非特異性條帶，可用于基因克隆。重組質(zhì)粒的紫外分光光度計測pcDNA3.1(+)-PKC-δ：A260/A280=1.868。pcDNA3.1(+)-PKC-δ經(jīng)過量的EcoRⅠ單酶切后，如圖1(C)所示，電泳結(jié)果顯示酶切完全，以重組質(zhì)粒為模板應(yīng)用PCR反應(yīng)擴增插入載體的PKC-δ基因片段與擴增獲得的片段大小相同。重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果與理論序列一致，片段大小正確，可見PKC-δ重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，PKC-δ基因序列準(zhǔn)確無誤。

2.2脫氧核酶體外切割效應(yīng)及對HepG2.2.15細(xì)胞生長的影響

實驗將脫氧核酶對PKC-δ的特異性切割作用進行了檢測。利用RT-PCR檢測PKC-δ表達，DRz、DRz-s、asON對照組對HepG2.2.15細(xì)胞PKC-δ mRNA的影響,可知轉(zhuǎn)染后DRz 、DRz-s能有效降低細(xì)胞內(nèi)的PKC-δmRNA表達，且DRz-s作用稍強，而asON沒有降低細(xì)胞內(nèi)的PKC-δ mRNA表達的作用。

圖1　(A)總RNA電泳結(jié)果;(B)RT-PCR PKC-δ cDNA片段；(C)條帶1，pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒3,pcDNA3.1(+) 和 PKC-δ.重組質(zhì)粒4,EcoR I.重組質(zhì)粒.

MTT法測定細(xì)胞的生長狀態(tài)，如圖2所示。不同試劑轉(zhuǎn)染后不同時間細(xì)胞的生長狀態(tài)?？梢钥闯鲛D(zhuǎn)染48 h內(nèi)：陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑組細(xì)胞生長緩慢，無明顯變化；DRz、DRz-s、asON試劑組較陰性對照組細(xì)胞生長旺盛，與asON組相似；DRz和DRz-s組細(xì)胞生長速度明顯加快，細(xì)胞數(shù)量較多，狀態(tài)較好，DRz-s組細(xì)胞生長略快。48 h后，陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑和asON組細(xì)胞仍然緩慢生長，而DRz和DRz-s組細(xì)胞生長速度明顯下降。轉(zhuǎn)染96 h后，各組細(xì)胞生長速度幾乎相同。

圖2　培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞與DRz,DRz-s and asON不同

3討論

脫氧核酶對底物RNA的催化活性取決于脫氧核酶的設(shè)計，DRz、DRz-s具有催化切割底物RNA的特異作用。分析原因其GC含量適宜，結(jié)合臂9nt屬于催化效率最強的長度，且處于易于被脫氧核酶接近的位置，能與PKC-δ上的DNA位點發(fā)生特異性的結(jié)合，通過競爭作用而阻礙基因啟動區(qū)上位點的結(jié)合，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中阻斷PKC-δ的活化，阻滯進一步信號傳導(dǎo)過程，使抑癌基因表達受到抑制。對DRz 5′和3′端的兩個磷酸二酯鍵進行硫代修飾形成DRz-s，在一定程度上穩(wěn)定性提高而又能保持DRz的大部分剪切活性。為了證明DRz對PKC-δ表達的抑制效應(yīng)并非完全源自其識別序列的反義效應(yīng)，實驗設(shè)計了與DRz底物識別序列一致的反義寡聚核苷酸asON作為對照。結(jié)果顯示asON無催化切割作用。這表明基因表達的阻斷效應(yīng)不是以其識別序列的反義效應(yīng)所致，而是由于DRz對底物PKC-δ RNA的特異性切割所致。

DRz、DRz-s均能有效降低HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)PKC-δmRNA表達，且DRz-s作用更強，說明硫代修飾后的DRz-s能提高抗核酸酶降解的能力，所以具有更高的切割作用。asON作用遠(yuǎn)不及DRz、DRz-s，說明其有封閉作用但無切割效果。MTT實驗結(jié)果表明脫氧核酶抑制PKC-δ基因表達呈現(xiàn)時間依賴趨勢。當(dāng)PKC-δ基因的表達受到抑制后，其抑癌活性消失，癌細(xì)胞生長旺盛，但是脫氧核酶對PKC-δ基因的表達抑制作用并不是持續(xù)不變的。隨著時間的延長，這種抑制作用逐漸減弱。

本實驗DRz特異性地切割PKC-δ后，PKC-δ表達受到抑制，其活性消失(包含去磷酸化作用)，不能發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能，肝癌細(xì)胞則加速生長。說明作為PKC家族重要成員的PKC-δ在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要的調(diào)控作用?？赡艹蔀楦伟┗蛱娲委煹乃幬?，具體的分子機制還需進一步探索。

參考文獻：

[1]Pearson RB,Kemp BE.Protein kinase phosphorylation site sequences andconsensus specificity motifs:tabulations[J].Methods Enzymol 1991;200:62.

[2]Newton AC.Protein kinase C;structure,function and regulation[J].Biol Chem，1995，270:28495.

[3]S.Stabel,P.J.Parker,Protein kinase C,Pharmacol[J].Ther.51(1991) 71.

[4]M.Castagna,Y.Takai,K.Kaibichi,K.Sano,U.Kikkawa,Y.Nishizuka,Direct activation of calcium-activated,phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters[J].Biol.Chem.257 (1982) 7847.

[5]W.C.Faquin,T.J.Schneider,M.A.Goldberg,Modulators of protein kinase C inhibit hypoxia-induced erythropoietin production,Exp[J].Hematol.21 (1993) 420.

[6]Reifel-Miller AE,Conarty DM,Valasek KM,Iversen PW,Burns DJ,Birch KA.Protein kinase C isozymes differentially regulate promoters containing PEA-3/12-O- tetradecanoyl-13-acetate response element motifs[J].Biol Chem，1996，271:21666.

[7]Das KC,White CW.Activation of NF-κB by antineoplastic agents.Role of protein kinase C[J].Biol Chem 1997;272:14914.

[8]Catley MC,Cambridge LM,Nasuhara Y,Ito K,Chivers JE,Beaton A,et al.Inhibitors of protein kinase C (PKC) prevent activated transcription.Role of events downstream of NF-κB DNA binding[J].Biol Chem 2004;279:18457.

[9]Soh JW,Weinstein IB.Roles of specific isoforms of protein kinase C in the transcriptional control of cyclin D1 and related genes[J].Biol Chem 2003;278:34709.

[10]Khachigian LM.Catalytic DNAs as potential therapeutic agents and sequence specific molecular tools to dissect biological function[J].Clin Invest，2000,106:1189.

[11]Li Y and Breaker RR.Deoxyribozymes:new players in the ancient game of biocatalysis[J].Curr Opin Struct Biol 1999,9:315.

[12]Sugimoto N,NakanoS,Katoh M,etal.Theermodynamic parameters topredictstability of RNA/DNA hybridduplexes[J].Biochemistry1995,34:11211.

[13]Li J，Zheng W，Kwon AH，et al.In vitro selection and characterization of a highly efficient Zn(Ⅱ)-dependent RNA-cleaving deoxyribozyme[J].Nucleic Acids Res，2000，28(2)：481.

[14]Li Y，Breaker RR.Phosphorylating DNA with DNA.Proc[J]．Natl Acad Sci USA，1999，96(6)：2746.

[15]Liu Y，Breaker RR.Capping DNA WITH dna[J].Biochemistry，2000，39(1)：3106.

[16]Carmi N，Breaker RR.Characterization of DNA-cleaving deoxyribozyme[J]. Bioorg Med Chem，2001，9(10)：2589.

[17]Liu Z,Mei SH,Brennan JD,et al.Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing motion specificities and Ph dependences[J].Am Chem Soc.2003,125(25):7539.

[18]Cieslak M,Szymanski J,Adamiak RW,et al.Structural rearrangements of the 10-23 DNAzyme to bet integrin subunit mRNA induced by cations and theire to the catalytic activity[J].Biol Chem.2003,278(48):47987.

[19]Okumoto Y,Sugimoto N.Development of a novel functional biosensor witha (2+)-dependent deoxyribozyem[J].Nucleic Acids Symp Ser，2000,(44):79.

[20]Gairns M J,Hopkins T M,Withenrington C,Wang L,Sun L Q.Target site selection for an RNA-cleaving catalytic DNA[J]．Nat Biotechnol,1999,17(5):480.

(收稿日期：2015-06-19)

作者簡介：魏卓，女，吉林省長春市人，碩士研究生，中級檢驗師。羅速，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，北華大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室。

文章編號：1007-4287(2016)01-0028-04

*通訊作者

基金項目：吉林省衛(wèi)生計生青年科研課題(2014Q009)