李雪杰，隋小芳，王鳳玲，索樹(shù)珍，楊　軍,董文崴，張磊藝

(1.佳木斯大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究生；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科；黑龍江 佳木斯154002；

3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科)

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抑制miRNA-291b-3p表達(dá)對(duì)H9C2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路活性的影響

李雪杰1，隋小芳2*，王鳳玲2，索樹(shù)珍1，楊軍3,董文崴3，張磊藝3

(1.佳木斯大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究生；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科；黑龍江 佳木斯154002；

3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科)

摘要：目的本文探討抑制miRNA-291b-3p表達(dá)在大鼠心肌細(xì)胞胰島素抵抗中的作用，并分析其可能的作用機(jī)制。方法①構(gòu)建miR-291b-3p mimics 和inhibitor 腺病毒載體，感染H9C2細(xì)胞48 h，分析miR-291b-3p 水平、AKT/GSK 信號(hào)通路活性和糖原水平的變化。②TNF-α刺激心肌細(xì)胞24 h后，再用miR-291b-3p inhibitor 腺病毒載體感染H9C2細(xì)胞24 h，檢測(cè)AKT/GSK信號(hào)通路活性和細(xì)胞糖原水平，驗(yàn)證TNF-α通過(guò)影響miR-291b-3p表達(dá)水平導(dǎo)致心肌細(xì)胞胰島素抵抗。結(jié)果①miR-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2細(xì)胞48 h，miR-291表達(dá)水平降低，AKT/GSK信號(hào)通路活性升高，心肌細(xì)胞糖原水平降低；②低表達(dá)miR-291b-3p能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的AKT/GSK通路活性和糖原水平降低。結(jié)論低表達(dá)miR-291b-3p可促進(jìn)AKT/GSK 信號(hào)通路活性，并改善TNF-α引起的胰島素抵抗。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0025)

近年研究表明，胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制，糖耐量正常冠心病患者發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，其機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞葡萄糖攝取，改變心肌能量代謝有關(guān)。隨著對(duì)miRNAs的深入研究，越來(lái)越多的結(jié)果表明，miRNAs廣泛參與心血管系統(tǒng)的分化、發(fā)育生過(guò)程，并調(diào)節(jié)其生理病理過(guò)程[2]。不同miRNA涉及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、心肌缺血/再灌注損傷、心肌纖維化及心肌肥大、血壓調(diào)節(jié)、心律失常等。miRNA將成為未來(lái)心血管病診斷及治療的全新靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及主要材料來(lái)源

大鼠心肌細(xì)胞株H9C2購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。H-DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；TNF-α 購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司；一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。miR-291b-3p低表達(dá)腺病毒載體(AD-291b-3p inhibitor)構(gòu)建與純化交由上海吉?jiǎng)P科技有限公司完成。肌、肝糖原檢試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

將H9c2細(xì)胞置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞達(dá)80%-90%豐度時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，按1：3比例接種于新培養(yǎng)瓶中傳代或六孔板中用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞模型的建立

將細(xì)胞隨機(jī)分為四組并接種于6孔板中:陰性對(duì)照(NCi)組，AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染(291i)組，TNF-α處理(291i+TNF-α)組，TNF-α對(duì)照(NCi+ TNF-α)組。

1.4miR-291b-3p表達(dá)檢測(cè)

收集上述前兩組處理后的細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PT-PCR檢測(cè)。采用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄 miRNA合成cDNAR，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀行PCR。采用△循環(huán)閾值(Ct)法處理結(jié)果。引物設(shè)計(jì)如下：

引物名稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄引物序列5’-3’miR-291b-3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAACU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名稱(chēng)PCR引物序列5’-3’miR-291b-3pGCAAAGTGCATCCATTTTGTTTGTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCUniverseprimerGTGCAGGGTCCGAGGT

1.5觀察miR-291b-3p水平變化對(duì)胰島信號(hào)通路及糖原合成的影響

對(duì)上述AD-291b-3pinhibitor及其陰性對(duì)照、TNF-α處理及對(duì)照組，分別處理后，收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)p-AKT、AKT、p-GSK、GSK水平；按肌、肝糖原檢試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)心肌細(xì)胞中糖原水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？尚艆^(qū)間為95%，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1低表達(dá)miR-291b-3p增強(qiáng)細(xì)胞AKT/GSK 信號(hào)通路活性

在H9C2細(xì)胞中，我們用AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2細(xì)胞48 h。結(jié)果顯示miR-291b-3p表達(dá)水平明顯降低(圖1A)，AKT和GSK磷酸化水平升高，細(xì)胞中糖原水平顯著降低(圖1B，C)。由此可見(jiàn)，低表達(dá)miR-291b-3p能夠增強(qiáng)AKT/GSK信號(hào)通路活性。

A.miR-291b-3p的表達(dá)水平；B.糖原合成水平；C.western blot檢測(cè)AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

2.2抑制miR-291b-3p表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的心肌胰島素抵抗

為了證明miR-291b-3p參與TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗，用10 ng/ml TNF-α處理24 h后，AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，檢測(cè)AKT/GSK信號(hào)通路和糖原水平。 結(jié)果顯示，低表達(dá)miR-291b-3p能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)糖原水平的促進(jìn)作用(圖2A)和對(duì)AKT/GSK信號(hào)通路活性抑制作用(圖2B)。由此，說(shuō)明TNF-α通過(guò)調(diào)節(jié)miR-291b-3p表達(dá)水平而影響胰島素信號(hào)通路活性。

A.糖原合成水平；B.western blot檢測(cè)AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

3討論

目前，學(xué)者們主要關(guān)注肝臟、骨骼肌和脂肪胰島素抵抗的作用，少有對(duì)心肌細(xì)胞胰島素抵抗相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。而心肌細(xì)胞胰島素抵抗水平同心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血時(shí)使用胰島素調(diào)節(jié)血糖代謝對(duì)心臟有保護(hù)作用，可減少心肌缺血/在灌注后的損傷[3]。因此改善心肌細(xì)胞胰島素敏感性對(duì)維護(hù)心肌正常生理功能具有重要作用，可以作為防治胰島素抵抗相關(guān)心血管疾病的手段。

有研究發(fā)現(xiàn)[4]，通過(guò)激活 PI3K/AKT 信號(hào)通路可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取。在我們先前研究中已證實(shí)TNF-α引起H9C2細(xì)胞中AKT/GSK信號(hào)通路活性，升高細(xì)胞中糖原水平，且過(guò)表達(dá)miR-291b-3p與TNF-α結(jié)果一致。越來(lái)越多的研究表明miRNA 能夠廣泛參與到胰島素信號(hào)通路[5]以及心血管疾病[6]的調(diào)控中，在冠心病發(fā)病機(jī)制的各個(gè)環(huán)節(jié)中miRNA都發(fā)揮作用[7]。miR-291b-3p[8]屬于miR-290家族，已有研究證實(shí)其參與肝臟胰島素抵抗的AKT/GSK信號(hào)通路，該家族位于染色體7上的2200 bp的堿基片段，可以調(diào)控各種細(xì)胞信號(hào)通路[9]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在H9C2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-291b-3p能夠抑制AKT/GSK信號(hào)通路活性，升高細(xì)胞糖原水平；在H9C2細(xì)胞中低表達(dá)miR-291b-3p能夠增強(qiáng)AKT/GSK信號(hào)通路活性，降低細(xì)胞糖原水平。說(shuō)明miR-291b-3p能夠調(diào)節(jié)H9C2細(xì)胞發(fā)生胰島素信號(hào)敏感性。為了明確miR-291b-3p在TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞胰島素抵抗中的作用，我們?cè)诘捅磉_(dá)miR-291b-3p同時(shí)用TNF-α處理H9C2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制miR-291b-3p表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的心肌細(xì)胞胰島素抵抗。進(jìn)一步說(shuō)明了，miR-291b-3p確實(shí)參與了TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胰島素抵抗。

綜上所述，在心肌細(xì)胞模型上，通過(guò)抑制miR-291b-3p表達(dá)水平，可增加AKT/GSK信號(hào)通路活性，使細(xì)胞中糖原合成水平升高。我們將進(jìn)一步尋找其作用靶基因，并完善體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，為胰島素抵抗相關(guān)的心血管疾病的診斷及治療提供了新的思路。

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關(guān)鍵詞：心肌細(xì)胞；胰島素抵抗；miR-291b-3p；TNF-α

MiR-291b-3p regulates activation of insulin signal pathway in H9C2 cellLIXue-jie1,SUIXiao-fang2*,WANGFeng-ling2,etal.(1.Geriatrics,thefirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,postgraduatestudent；2.DepartmentofGeriatrics,thefirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversityHeilongjiangJiamusi154002)

Abstract:ObjectiveOur study aims to identify the role of microRNA-291b-3p in myocardial insulin resistance and the molecular mechanisms.Methods①I(mǎi)n order to inhibit miR-291b-3p,H9C2 was infected with AD-291b-3p inhibitor for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.②H9C2 was treated with10 ng/ml TNF-α for 24 h and then infected with AD-291b-3p inhibitor for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.Results①I(mǎi)n H9C2 cells Infected with AD-miR-291b-3p inhibitor,the levels of miR-291b-3p and glycogen level were decresased and activation of AKT/GSK pathway was promoted.②Down-regulation of miR-291b-3p could revese TNF-α-induced insulin resistance.

ConclusionDown-regulation of miR-291b-3p increased activation of AKT/GSK pathway,and revese TNF-α-induced insulin resistance.

Key words:Myocardial cell,insulin resistance,miR-291b-3p,TNF-α

(收稿日期：2015-08-15)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：Q781

文章編號(hào)：1007-4287(2016)01-0025-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目:黑龍江省自然基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：H2015076)；黑龍江省中醫(yī)藥中青年科技攻關(guān)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：ZQG-055)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：LM2015_013)