?

*并列通訊作者

Triptolide 抑制角膜免疫反應(yīng)及TGF-β誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原收縮實(shí)驗(yàn)研究

高珣祎1,張文松2,張紅1,王玲1*，周鴻雁1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼科)

雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide，TP)是中藥雷公藤的一種成分，已證實(shí)具有多種藥理作用如抗炎、免疫調(diào)節(jié)等[1]。感染性角膜炎是世界范圍內(nèi)，尤其是發(fā)展中國家的主要致盲性眼病之一。TNF-α作為Thl細(xì)胞分泌產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子之一，與IL-2、IFN-1等共同介導(dǎo)細(xì)胞免疫[2，3]，這些炎性因子及趨化因子可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞對組織的浸潤功能?？梢?，角膜感染時(shí)，控制角膜炎性細(xì)胞浸潤及角膜炎癥反應(yīng)是治療角膜炎的重要環(huán)節(jié)[4，5]。角膜基質(zhì)中含有大量膠原蛋白，角膜膠原蛋白的正常代謝和結(jié)構(gòu)對于維持角膜的通透性和形態(tài)有著關(guān)鍵作用。TGF-β可以促進(jìn)多種細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)Ⅰ 型膠原的轉(zhuǎn)錄、翻譯等機(jī)制，促進(jìn)局部成纖維細(xì)胞增殖活化，這些與角膜瘢痕形成密切相關(guān)[6]。角膜膠原能維持角膜的正常形狀，如可抑制角膜膠原收縮量則可在角膜炎癥晚期膠原重塑過程中抑制角膜瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)我們通過測定每個(gè)皿中單個(gè)細(xì)胞釋放的TNF-α量，以及膠原直徑的量來探討TP對角膜免疫反應(yīng)和角膜炎癥晚期瘢痕收縮的影響。

1材料和方法

1.1材料MEM,DPBS,膠原酶,蛋白酶，TP，TGF-β,Ⅰ型膠原。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞采集新西蘭大耳白兔(重2.0-2.5 KG)來自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，兔眼球摘除后用含抗生素DPBS水洗，機(jī)械方法去除角膜內(nèi)皮及角膜上皮細(xì)胞，余下的角膜組織在37℃培養(yǎng)于含2 mg/mL dispase中1 h，并在collagenase(2 mg/mL,in MEM)37℃培養(yǎng)至獲得單層貼壁角膜基質(zhì)細(xì)胞，然后獲得的角膜基質(zhì)細(xì)胞用10% FBS 培養(yǎng)至第4-7代，用于實(shí)驗(yàn)研究。角膜基質(zhì)細(xì)胞三維培養(yǎng)：角膜基質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化，15,000 轉(zhuǎn)離心 5 min，用無血清培養(yǎng)液混懸，I型膠原，DMEM，0.26 M Na2CO3，0.2 M HEPES(pH 7.3)及角膜基質(zhì)細(xì)胞混懸液在冰上按比例混合后放置于24孔板并在溫箱中培養(yǎng)至凝固，然后加入TGF-β及相關(guān)濃度TP，然后再放置于溫箱中培養(yǎng)不同時(shí)間。

1.2.2Triptolide對0.1 μg/ml LPS刺激U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a的抑制作用實(shí)驗(yàn) 將10萬U937巨噬細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640中，經(jīng)100Nm PMA 刺激培養(yǎng)48 h，使細(xì)胞貼壁，DPBS水洗，含10%FBS的RPMI1640換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，設(shè)計(jì)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別是：單純加入0.1 μg/ml LPS組，僅含培養(yǎng)液的單純對照組，0.1 μg/ml LPS 聯(lián)合0.03,0.3，3 μM TP組，分別加入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于含1%FBS的RPMI1640中1 h，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA方法檢測每皿中單個(gè)細(xì)胞釋放的TNF-a量。

1.2.3TP對TGF-β 誘導(dǎo)角膜基質(zhì)膠原收縮實(shí)驗(yàn)的抑制作用實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)方法：兔角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于混合I型膠原的三維培養(yǎng)體系中，在培養(yǎng)體系中添加TGF-β1 μg/ml即可誘導(dǎo)角膜基質(zhì)膠原收縮，膠原收縮的量由對膠原直徑的測量獲得。

2結(jié)果

2.1TP對0.1μg/mlLPS刺激U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：TP可在濃度為0.3,3μM時(shí)抑制LPS刺激U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-a量。

圖1　　TP對0.1μg/mlLPS刺激U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生

2.2TP抑制TGF-β誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)膠原收縮圖2示在添加TGF-β1μg/ml體系中，分別加入0.03,0.3,3μMTP，數(shù)據(jù)顯示Tp可抑制TGF-β誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)膠原收縮量，并呈劑量依賴關(guān)系。

圖2　　不同濃度的TP對培養(yǎng)體系角膜基質(zhì)膠

2.3TP抑制TGF-β誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)膠原收縮圖3顯示，在TGF-β誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)膠原收縮模型中，在體系內(nèi)添加及不添加3μMTP時(shí)，與對照組相比，添加組在第3天開始抑制膠原收縮量。

圖3　　3μMTp可在第3天開始抑制培養(yǎng)體系角膜基質(zhì)

3討論

角膜炎是一種嚴(yán)重危害視力的眼科疾病。若診療不及時(shí)，可能導(dǎo)致角膜潰瘍、穿孔、眼內(nèi)炎，嚴(yán)重者需行眼球摘除。角膜基質(zhì)主要由細(xì)胞外基質(zhì)(主要為Ⅰ型膠原纖維)和角膜基質(zhì)細(xì)胞(角膜成纖維細(xì)胞)組成。當(dāng)角膜受到外界刺激時(shí)，角膜免疫細(xì)胞被激活可以產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子和趨化因子，可介導(dǎo)角膜細(xì)胞增殖、壞死以及炎性細(xì)胞浸潤角膜。角膜炎時(shí)角膜的主要病理特點(diǎn)是有大量的吞噬細(xì)胞浸潤和明顯的炎癥反應(yīng)。LPS可誘導(dǎo)U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，TNF-α通過影響NF-κB的活性來作用與角膜免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞炎癥因子[7，8]。TGF-β可通過mTOR途徑和MAPK途徑誘導(dǎo)角膜肌纖維細(xì)胞形成[9，10]。

雷公藤是衛(wèi)矛科一年生藤本植物，是我國一種傳統(tǒng)中草藥。TP是從雷公藤里提煉分離出的一種二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種活性，TP有抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌，以及抑制角膜肌纖維細(xì)胞形成的功效[11]，可能會(huì)有降低角膜炎癥反應(yīng)和減輕角膜炎癥晚期瘢痕形成的功能。

本研究結(jié)果顯示LPS可以刺激U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，TP可以抑制U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的量，抑制的程度與加入TP的濃度呈正相關(guān)，表明TP可以作為對抗角膜炎癥反應(yīng)的新型藥物。角膜基質(zhì)膠原收縮模型中，在體系內(nèi)添加及不添加3μMTP時(shí)，與對照組相比，添加組在第3天開始抑制膠原收縮量。在添加TGF-β1μg/ml的體系中，分別加入0.03,0.3,3μMTP，數(shù)據(jù)顯示Tp可抑制TGF-β誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)膠原收縮量，并呈劑量依賴關(guān)系。這樣的結(jié)果表明了TP對于抑制TGF-β介導(dǎo)的角膜膠原收縮有抑制作用，從而對于角膜炎癥晚期的瘢痕形成應(yīng)有一定的抑制作用。

TP可通過抑制U937巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α量從而抑制角膜炎癥反應(yīng)；TP對于TGF-β介導(dǎo)的角膜膠原收縮有抑制作用并呈劑量依賴關(guān)系，可以抑制角膜炎癥晚期的角膜瘢痕收縮，TP是有潛力的治療角膜炎癥性疾病的制劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]RanyiaM,XianxiW,HuiGe,etal.Triptolideinducesanti-inflammatorycellularresponses[J].AmJTranslRes,2009,1(3):267.

[2]KumagaiN,FukudaK,IshimuraY,etal.SynergisticinductionofeotaxinexpressioninhumankeratocytesbyTNF-alphaandIL-4orIL-13[J].InvestOphthalmolVisSci,2000,41:1448.

[3]SeungHoonLee,KyoungWooKim,Kyong-MiMin,etal.AngiogeninReducesImmuneInflammationviaInhibitionofTANK-BindingKinase1ExpressioninHumanCornealFibroblastCells[J].MediatorsInflamm,2014,861435.

[4]AzucenaKakazu,JiuchengHe,SachidanandaKenchegowda,etal.BazanLipoxinA4inhibitsplatelet-activatingfactorinflammatoryresponseandstimulatescornealwoundhealingofinjuriesthatcompromisethestroma[J].ExpEyeRes,2012,103:9.

[5]SharonAltmann,MeganToomey,BrittanyNesbit,etal.KineticsofImmuneCellInfiltrationinVacciniaVirusKeratitis[J].InvestOphthalmolVisSci,2010,51(9):4541.

[6]StevenE.WilsonCornealmyofibroblastbiologyandpathobiology:Generation,persistence,andtransparency[J].ExpEyeRes,2012,99(1):78.

[7]SeungHoonLee,KyoungWooKim,Kyong-MiMin,etal.AngiogeninReducesImmuneInflammationviaInhibitionofTANK-BindingKinase1ExpressioninHumanCornealFibroblastCells[J].MediatorsInflamm,2014,861435.

[9]Guo-LingChen,Jing-JingZhang,XinKao,etal.Emodinameliorateslipopolysaccharides-inducedcornealinflammationinrats[J].IntJOphthalmol,2015,8(4):665.

[9]MilaniBY,MilaniFY,ParkDW,etal.RapamycinInhibitstheProductionofMyofibroblastsandReducesCornealScarringAfterPhotorefractiveKeratectomy[J].InvestOphthalmolVisSci,2013,54(12):7424.

[10]LongShi,YuanChang,YongmeiYang,etal.ActivationofJNKSignalingMediatesConnectiveTissueGrowthFactorExpressionandScarFormationinCornealWoundHealing[J].PLoSOne,2012,7(2):e32128.

[11]BrinkerAM,MaJ,LipskyPE,etal.MedicinalchemistryandpharmacologyofgenusTripterygium(Celastraceae)[J].Phytochemistry,2007,68(6):732.

《中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)》雜志社聲明

本刊為中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊(中國科技核心期刊)、中國學(xué)術(shù)期刊綜合數(shù)據(jù)庫來源期刊、《中國期刊網(wǎng)》、《中國學(xué)術(shù)期刊》(光盤版)》全文收錄期刊、《萬方數(shù)據(jù)庫—數(shù)據(jù)化期刊群》、《中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫》、中國科技期刊數(shù)據(jù)庫等入網(wǎng)期刊。本刊已許可上述單位以數(shù)字化方式復(fù)制、匯編、發(fā)行、信息網(wǎng)絡(luò)傳播本刊全文。作者著作權(quán)使用費(fèi)與本刊稿酬一次性給付。如作者不同意將文章編入以上數(shù)據(jù)庫，請?jiān)趤砀鍟r(shí)聲明，本刊將做適當(dāng)處理，否則本刊視為同意收錄。

(收稿日期：2015-11-25)

文章編號：1007-4287(2016)01-0019-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81300727)資助；吉林大學(xué)白求恩B計(jì)劃項(xiàng)目(吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)2012230)