包艷存，李 芳，李書(shū)華，李 霞

(山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊 261041)

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不同組培條件對(duì)蘆筍試管苗玻璃化的影響

包艷存，李 芳，李書(shū)華，李 霞

(山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊 261041)

蘆筍，學(xué)名石刁柏(Asparagusofficinalis)，屬百合科天冬門(mén)屬，是雌雄異株宿根性多年生植物，有“蔬菜之王”和“世界十大名菜之一”之稱(chēng)。其質(zhì)嫩味鮮，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，風(fēng)味獨(dú)特，深受世人的喜愛(ài)[1-2]。蘆筍雌雄異株，親本繁殖困難，分株法繁殖速度慢。組織培養(yǎng)能較好地保持良種的優(yōu)良性狀，繁殖系數(shù)高，應(yīng)用于蘆筍品種的雜交選育和親本繁殖過(guò)程中，可迅速擴(kuò)大親本數(shù)量，縮短育種年限，提高制種產(chǎn)量[3]。

多年組培經(jīng)驗(yàn)表明，在蘆筍組織培養(yǎng)中，反復(fù)繼代培養(yǎng)尤其是繼代增殖培養(yǎng)4～6代，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象。而玻璃化一旦形成，很難將其恢復(fù)成正常植株，嚴(yán)重影響了蘆筍的增殖效率。筆者通過(guò)對(duì)影響組培苗玻璃化的因素進(jìn)行研究，探討蘆筍繼代培養(yǎng)4～6代時(shí)由于大量試管苗玻璃化而影響增殖效率的解決途徑。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)于2014年在山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)材料供試材料為蘆筍育種材料“中21”，取自濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院新品種繁育基地。

1.3試驗(yàn)方法將經(jīng)過(guò)3代繼代增殖培養(yǎng)的愈傷組織，接種于增殖培養(yǎng)基中。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基。采用單因子對(duì)比試驗(yàn)，每個(gè)處理樣本為40個(gè)，分接在20瓶中，試驗(yàn)重復(fù)3次。添加6-BA 0.50 mg/L(涉及6-BA濃度影響除外)、NAA 0.05 mg/L、KT 0.10 mg/L，附加蔗糖40 g/L、瓊脂粉6 g/L(涉及蔗糖、瓊脂粉濃度影響除外)，pH 調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度25 ℃(溫度處理除外)，光照強(qiáng)度2 500 lx(光照強(qiáng)度處理除外)，光照時(shí)間12 h/d。以25 d為一周期，繼代培養(yǎng)2次。統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和玻璃化率，增殖系數(shù)=增殖苗數(shù)/接種苗數(shù)；玻璃化率=(玻璃化苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%。

1.3.1不同6-BA濃度的影響。6-BA濃度分別為0.3、0.5、0.8 mg/L及0.3與0.5 mg/L變換、0.5與0.8 mg/L變換，共5個(gè)處理。

1.3.2不同培養(yǎng)溫度的影響。接種后的培養(yǎng)溫度分別為20、25 ℃及20與25 ℃變溫處理，共3 個(gè)處理。變溫處理天數(shù)為20 ℃培養(yǎng)15 d，25 ℃培養(yǎng)10 d。

1.3.3不同光照強(qiáng)度的影響。光照強(qiáng)度分別為2 500、3 500、4 200 lx，共3個(gè)處理。

1.3.4不同蔗糖濃度的影響。培養(yǎng)基中添加的蔗糖濃度分別為40、50、60 g/L，共3 個(gè)處理。

1.3.5不同瓊脂濃度的影響。培養(yǎng)基中添加的瓊脂濃度分別為6、8、10 g/L，共3 個(gè)處理。

2結(jié)果與分析

2.1不同6-BA濃度的影響在進(jìn)行親本莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA濃度為0.8 mg/L時(shí)，增殖效果最好。由表1可知，在一次增殖中當(dāng)6-BA濃度達(dá)0.5 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最大，為1.70；當(dāng)6-BA濃度為0.8 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)反而下降。其原因是6-BA濃度為0.8 mg/L時(shí)玻璃化率達(dá)到50%，從而影響了其增殖系數(shù)(圖1)。這與蘆筍繼代增殖4～5代時(shí)，其玻璃化程度嚴(yán)重相吻合。當(dāng)6-BA濃度為0.3 mg/L時(shí)，一次玻璃化苗數(shù)最少，只有3株。隨著再次繼代培養(yǎng)，在6-BA濃度為0.3與0.5 mg/L的培養(yǎng)基上交換培養(yǎng)，雖然玻璃化苗比0.3 mg/L的多2株，但其增殖系數(shù)最大，達(dá)到2.950。因此選擇采用6-BA 0.3與0.5 mg/L的培養(yǎng)基上交換培養(yǎng)。

圖1　正常苗與玻璃化苗Fig. 1　Normal seedlings and vitrified seedlings

6-BA濃度6-BAconcentrationmg/L接種苗數(shù)Numberofinoculatedseedlings一次增殖苗數(shù)Thefirstproliferatedseedlings一次玻璃化苗數(shù)Thefirstvitrifiedseedlings二次增殖苗數(shù)Thesecondproliferatedseedlings二次玻璃化苗數(shù)Thesecondvitrifiedseedlings一次增殖系數(shù)Thefirstmultiplicationcoefficient一次玻璃化率Thefirstvitrificationrate∥%二次增殖系數(shù)Thesecondmultiplicationcoefficient0.3406539581.207.52.3750.54068890401.7020.02.2500.3/0.540--11810--2.9500.840502070751.2550.01.7500.5/0.840--8060--1.500

2.2不同培養(yǎng)溫度的影響由表2可知，不同培養(yǎng)溫度對(duì)蘆筍玻璃化有顯著影響，同時(shí)對(duì)增殖系數(shù)有極顯著影響。在一定溫度范圍內(nèi)(20～25 ℃)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，蘆筍試管苗玻璃化率明顯提高，在一次增殖中，25 ℃時(shí)增殖苗數(shù)最多，為68株。而在二次增殖時(shí)，20與25 ℃的變溫培養(yǎng)增殖苗數(shù)最多，為108株，玻璃化苗數(shù)10株，增殖系數(shù)為2.70；25 ℃時(shí)增殖苗數(shù)為90株，玻璃化苗數(shù)40株，增殖系數(shù)為2.25。綜合考慮，選擇20/25 ℃的變溫培養(yǎng)。

表2　不同培養(yǎng)溫度對(duì)繼代增殖及玻璃化的影響

2.3不同光照強(qiáng)度的影響由表3可知，不同光照強(qiáng)度對(duì)玻璃化率有顯著影響，隨著光照強(qiáng)度的增加，玻璃化率明顯降低。二次增殖時(shí)，當(dāng)光照強(qiáng)度為4 200 lx 時(shí)，玻璃化苗數(shù)只有8株，顯著低于2 500 lx 時(shí)的40株。增殖系數(shù)隨著光照強(qiáng)度的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但差異不顯著。當(dāng)光照強(qiáng)度為4 200 lx時(shí)，二次增殖系數(shù)最大，為2.75。因此選擇4 200 lx的光照強(qiáng)度。

表3　不同光照強(qiáng)度對(duì)繼代增殖及玻璃化的影響

2.4不同蔗糖濃度的影響由表4可知，蔗糖濃度對(duì)玻璃化率有顯著影響(尤其是二次培養(yǎng))，隨著蔗糖濃度的增加，玻璃化率明顯降低。二次增殖時(shí)，當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時(shí)，玻璃化苗數(shù)為14株，顯著低于40 g/L時(shí)的40株。增殖系數(shù)受蔗糖濃度的影響較小，但隨著蔗糖濃度的增加呈增加趨勢(shì)?？紤]到成本問(wèn)題，選擇蔗糖濃度為50 g/L。

表4　不同蔗糖濃度對(duì)繼代增殖及玻璃化的影響

2.5不同瓊脂濃度的影響由表5可知，不同瓊脂濃度對(duì)增殖系數(shù)有一定影響，在一定濃度范圍內(nèi)(6～8 g/L)，隨著瓊脂濃度升高，增殖系數(shù)有所上升。瓊脂濃度對(duì)玻璃化率(尤其是二次培養(yǎng))有顯著影響。當(dāng)瓊脂濃度為10 g/L 時(shí)，二次增殖玻璃化苗數(shù)最少，為12株，增殖系數(shù)為2.30。當(dāng)瓊脂濃度為8 g/L時(shí)，二次增殖系數(shù)為2.45。綜合考慮成本和增殖系數(shù)，選擇瓊脂濃度為8 g/L。

表5　不同瓊脂濃度對(duì)繼代增殖及玻璃化的影響

3結(jié)論與討論

筆者研究了蘆筍繼代增殖4～5代時(shí)，對(duì)其增殖效率和玻璃化率產(chǎn)生影響的因素，從而選擇合適的培養(yǎng)條件，順利度過(guò)增殖培養(yǎng)的危險(xiǎn)期。結(jié)果表明，6-BA濃度、培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、蔗糖與瓊脂濃度5種因素對(duì)繼代培養(yǎng)4～5代的蘆筍試管苗玻璃化都有顯著影響，其中以6-BA濃度、培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度的影響最大，蔗糖和瓊脂濃度對(duì)增殖系數(shù)沒(méi)有顯著影響。

該研究發(fā)現(xiàn)隨著瓊脂或蔗糖濃度的增加，玻璃化苗減少，但超過(guò)一定濃度也會(huì)降低蘆筍的增殖系數(shù)。當(dāng)瓊脂濃度為8 g/L 時(shí)，一次培養(yǎng)增殖所得苗數(shù)為72株，二次培養(yǎng)增殖所得苗數(shù)為98株。而當(dāng)瓊脂濃度為10 g/L時(shí)，一次培養(yǎng)增殖所得苗數(shù)為66株，二次培養(yǎng)增殖所得苗數(shù)為92株，增殖系數(shù)降低。原因可能是提高培養(yǎng)基中瓊脂或蔗糖濃度，可降低培養(yǎng)基中的滲透勢(shì)，阻礙細(xì)胞過(guò)度吸水，從而降低玻璃化苗的比例[4]。當(dāng)瓊脂濃度過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基硬化，影響了試管苗對(duì)養(yǎng)分的吸收，降低了增殖系數(shù)；蔗糖濃度過(guò)高時(shí)，碳源過(guò)剩，不利于分化，增殖系數(shù)降低[5]。

該試驗(yàn)中，隨著光照強(qiáng)度的增加，玻璃化率降低，增殖系數(shù)變大。金波等[6]、肖玉蘭等[7]認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)，植物的光合強(qiáng)度與光照強(qiáng)度成正相關(guān)，光照強(qiáng)光合作用強(qiáng)，合成更多的有機(jī)物，有利于試管苗的正常生長(zhǎng)，減少玻璃化現(xiàn)象，這與該試驗(yàn)結(jié)果一致。在一定光照強(qiáng)度范圍內(nèi)光照有利于植物生長(zhǎng)，當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)一定范圍后，對(duì)一些植物將產(chǎn)生負(fù)面影響[8]。Lees 等[9]認(rèn)為過(guò)高的光照強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致試管苗光合作用能力及量子效率降低。該試驗(yàn)結(jié)果表明4 200 lx為蘆筍組培適宜的光照強(qiáng)度。

周俊輝等[10]、時(shí)群等[11]研究表明，溫度的高低與玻璃化的產(chǎn)生具有一定的相關(guān)性，培養(yǎng)溫度升高，玻璃化率也增加。其原因可能是高溫會(huì)刺激細(xì)胞新陳代謝，細(xì)胞快速分裂，愈傷組織疏松，從而導(dǎo)致玻璃化[12]，這與該試驗(yàn)結(jié)果一致。但溫度對(duì)蘆筍的增殖系數(shù)也存在顯著影響，在一定范圍內(nèi)，溫度越高增殖系數(shù)越大，在蘆筍繼代增殖4代時(shí)，25 ℃時(shí)增殖系數(shù)最大，但第5代時(shí)，由于其大量玻璃化，增殖系數(shù)反而降低，表明溫度對(duì)玻璃化的影響大于其對(duì)增殖系數(shù)的影響。

Mujib 等[13]認(rèn)為6-BA 是組培苗玻璃化的根源之一，一定的6-BA 濃度誘導(dǎo)細(xì)胞分裂活性增強(qiáng)，加上襯質(zhì)勢(shì)高，新分裂的細(xì)胞膨脹、伸長(zhǎng)，擾亂了正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，出現(xiàn)不平衡，產(chǎn)生玻璃苗。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-BA 濃度越高，組培苗玻璃化率越高，此現(xiàn)象可能是Mujib等[13]所述原因?qū)е隆?/p>

綜合多種因素考慮，最終選擇MS培養(yǎng)基，附加蔗糖50 g/L，瓊脂粉8 g/L，pH 5.8，光照強(qiáng)度4 200 lx，光照時(shí)間12 h/d，每周期先在20 ℃培養(yǎng)15 d，再在25 ℃培養(yǎng)10 d。NAA 0.05 mg/L，KT 0.1 mg/L，先在6-BA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一代，再在6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方式度過(guò)蘆筍增殖培養(yǎng)玻璃化高峰期。

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摘要為有效解決蘆筍組培快繁繼代增殖培養(yǎng)4～6代時(shí)，由于玻璃化試管苗的嚴(yán)重出現(xiàn)而影響增殖效率的問(wèn)題，對(duì)6-BA濃度、培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、蔗糖濃度、瓊脂濃度等因素對(duì)蘆筍組培玻璃化及增殖效果的影響進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，玻璃化率隨著培養(yǎng)溫度和6-BA濃度的降低而有所降低，隨光照強(qiáng)度、蔗糖濃度和瓊脂濃度的增強(qiáng)而減弱。最終選擇MS培養(yǎng)基，附加蔗糖50 g/L,瓊脂粉8 g/L，光照強(qiáng)度4 200 lx，先6-BA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一代，再在6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每周期先在20 ℃培養(yǎng)15 d，再在25 ℃培養(yǎng)10 d的方式來(lái)度過(guò)蘆筍增殖培養(yǎng)玻璃化高峰期。

關(guān)鍵詞蘆筍；增殖培養(yǎng)；玻璃化；增殖系數(shù)

Effects of Tissue Culture Conditions on the Vitrification ofAsparagusofficinalisL.

BAO Yan-cun, LI Fang, LI Shu-hua et al(Weifang Academy of Agricultural Sciences, Weifang, Shandong 261041)

AbstractFactors affecting the vitrification and proliferation during the 4-6 generations ofAsparagusofficinalisL. were studied in tissue culture, such as 6-BA concentration, temperature, light intensity, sucrose concentration, agar concentration and other factors. Results showed that vitrification percentage reduced as the culture temperature and 6-BA concentration decreased, and weakened when the light intensity, sucrose concentration and agar concentration enhanced. MS culture medium adding 50 g/L sucrose and 8 g/L agar powder was selected with the light intensity being 4 200 lx. The first generation was cultured on medium with 0.3 mg/L 6-BA, and then transferred to medium with 0.5 mg/L 6-BA. In each cycle,A.officinaliswas firstly cultured at 20 ℃ for 15 days, and then at 25 ℃ for 10 days. By this way,A.officinaliscould go through its vitrification peak.

Key wordsAsparagusofficinalisL.; Proliferation culture; Vitrification; Multiplication coefficient

收稿日期2015-12-07

作者簡(jiǎn)介包艷存(1979- )，女，湖北隨州人，農(nóng)藝師，農(nóng)業(yè)推廣碩士，從事蘆筍育種與栽培工作。

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201003074-1-3)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 603.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-223-03