陳小婉　江英　仇志強　張小兵

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不同固定液對大鼠耳蝸一氧化氮合酶表達及透射電鏡觀察的影響△

陳小婉1江英2仇志強1張小兵1

【摘要】目的探尋用于觀察大鼠耳蝸誘生型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)表達及透射電鏡檢查最適合的固定液配比，簡化實驗手段。方法將正常大鼠6只(12耳,正常組)和慶大霉素耳中毒模型大鼠6只(12耳，模型組)各分為A、B兩組(每組各3只，6耳)，A組給予2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛、B組給予4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液心內(nèi)灌注耳蝸固定處死,然后進行耳蝸免疫組化染色及透射電鏡觀察，比較兩組耳蝸的染色和電鏡固定效果。結(jié)果正常組與模型組大鼠的耳蝸外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)等均有iNOS陽性表達;但正常組及模型組的A組耳蝸組織免疫組化染色有輕度溶解，背景染色不佳，B組耳蝸組織細胞染色清晰，對比度及透明度好，背景無明顯著色。正常組及模型組中A、B兩組電鏡下耳蝸細胞器等微結(jié)構(gòu)清晰。結(jié)論4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液心內(nèi)灌注的方法既能較好地固定大鼠耳蝸細胞器的結(jié)構(gòu)，也能較好的保留iNOS抗原。

【關(guān)鍵詞】大鼠；誘生型一氧化氮合酶；透射電鏡；固定液；慶大霉素

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-12-299：23

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151229.0923.004.html

△蘭州大學(xué)第一醫(yī)院青年基金資助(ldyyynqn201005)

1蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(蘭州730000)；2蘭州大學(xué)

NO的過量表達在慶大霉素耳毒性的機制中起到了重要的作用。誘生型一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)的檢測被廣泛應(yīng)用于慶大霉素類藥物耳毒性的相關(guān)研究中，且常同時聯(lián)合電子顯微鏡觀察耳蝸細胞器的形態(tài)變化，已有研究分別采用4.0%甲醛和2.5%戊二醛固定耳蝸的方法[1，2]，但是處理耳蝸耗費時間較多、對實驗技術(shù)的要求較高，易影響實驗結(jié)果。近年的報道多采用多聚甲醛-戊二醛混合液心內(nèi)灌注的固定方法[3~6]，本研究擬通過采用2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液及4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液對大鼠進行心內(nèi)灌注，比較兩種固定液處理后大鼠耳蝸iNOS表達及電鏡觀察結(jié)果，以期探尋適合同時進行耳蝸iNOS檢測和電鏡觀察的固定液配比。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組實驗動物為Wistar大鼠12只(24耳)，雄性，體重200~250 g(蘭州大學(xué)動物實驗中心提供)，ABR反應(yīng)閾均正常；將實驗大鼠隨機分為兩組：正常組6只(12耳)、慶大霉素耳中毒模型組(模型組)6只(12耳)。

1.2實驗試劑及儀器iNOS試劑盒(武漢博士德公司)，多克隆二抗(武漢博士德公司)。透射電鏡(日本JEOL-1230型，日本電子公司)。

1.3慶大霉素模型組造模模型組大鼠每天腹腔注射慶大霉素150 mg/kg，連續(xù)10天；正常組每天腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)10天；完成注射后兩組分別檢測ABR。

1.4耳蝸取材固定方法模型組及正常組完成腹腔注射及ABR測試后，將每組大鼠再分為A、B兩組，每組3只(6耳)，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后A組給予2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液、B組給予4%多聚甲醛-0.5%戊二醛心內(nèi)灌注處死，至灌注側(cè)對側(cè)股靜脈流出清亮固定液后繼續(xù)推注固定液約50 ml，取出耳蝸，4 ℃相應(yīng)固定液中過夜。

1.5各組耳蝸及腎臟組織iNOS表達檢測所有大鼠左耳以10%甲酸脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)切片，檸檬酸修復(fù)，檢測耳蝸組織中iNOS的表達；iNOS免疫組化SABc法步驟：切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度水化，抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，滴加兔抗鼠iNOS抗體(購自武漢博士德試劑公司)，4 ℃冰箱過夜，PBS洗，加二抗(生物素化羊抗兔IgG)，37 ℃放置30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同；取正常組大鼠腎臟4 ℃相應(yīng)固定液中過夜，作為陽性對照。耳蝸毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)等部位的細胞核、胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為iNOS表達陽性；腎小管細胞的胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達陽性，顏色越深表達越強。

每側(cè)耳蝸連續(xù)切片5張，每張腎臟切片隨機抽取10個高倍視野，染色后依據(jù)以下標準評分：①切片完整、貼片恰當(dāng)10分；②切片較薄和均勻20分； ③無皺折10分；④無刀痕10分；⑤染色清晰、對比度、透明度好30分；⑥目標細胞是否完整、溶解 10分；⑦靶點是否正確10分；⑧有無背景著色5分；總分越高，切片質(zhì)量越好。

1.6透射電鏡觀察各組耳蝸細胞超微結(jié)構(gòu)各組大鼠的右耳耳蝸以10%EDTA脫鈣后樹脂包埋，切片，透射電鏡觀察耳蝸毛細胞的超微結(jié)構(gòu)，觀察線粒體、高爾基體等結(jié)構(gòu)是否清晰、組織對比度是否良好。

2結(jié)果

2.1各組給藥前后ABR閾值正常組給藥前后ABR閾值無明顯變化，模型組動物給藥后ABR閾值較給藥前明顯增高(表1)。

±s)

注：*與同組給藥前比較，P<0.05

2.2不同固定液處理后各組耳蝸iNOS表達比較A、B兩組動物的耳蝸毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋內(nèi)均有iNOS棕黃色顆粒沉著，其中正常組大鼠顯色強度較模型組大鼠弱。正常組及模型組的A組細胞有輕度溶解、背景染色不佳(圖1a、b)。正常組及模型組的B組組織固定效果較好，耳蝸切片較薄、均勻，細胞染色清晰、對比度、透明度好，背景無明顯著色(圖1d、e)。正常組及模型組中A、B亞組切片質(zhì)量評分見表2，B組評分均高于A組。正常大鼠腎臟兩種固定液組(A、B組)的iNOS均在腎小管表達(圖1c、f)。

表2　正常組及模型組中A、B兩組耳蝸切片

注：*與B組比較，P<0.05

2.3正常組及模型組耳蝸電鏡觀察電子顯微鏡下觀察，兩組內(nèi)耳毛細胞內(nèi)的線粒體、高爾基體等均結(jié)構(gòu)清晰，無明顯差別(圖2)。

3討論

慶大霉素的耳毒性機制被證實和氧化損傷有關(guān)，NO在其中起重要作用；近來研究的熱點集中在抗氧化劑、iNOS抑制劑等對其耳毒性的保護作用，如丹參、?；撬岬人幬锟梢酝ㄟ^降低iNOS的表達保護耳蝸的功能[2,7~9]。由于NO氣體分子的特性，現(xiàn)常采用免疫組織化學(xué)方法檢測NOS 的水平以評估NO的水平，需同時觀察組織的形態(tài)學(xué)變化時，多聯(lián)合電子顯微鏡觀察組織細胞的超微結(jié)構(gòu)。免疫組化方法要求最大限度破壞細胞膜， 增加抗體的穿透性來標記抗原，多采用4%的多聚甲醛固定組織，而電子顯微鏡要求保留細胞的膜性結(jié)構(gòu)，使顯微結(jié)構(gòu)清晰，多用2.5%戊二醛固定組織。因此，以往的實驗大多采用將實驗動物快速斷頭取出聽泡，兩耳分別給予4.0%多聚甲醛和2.5%戊二醛進行前庭窗灌注的方法來固定[1，2]；這種方法對實驗操作的技術(shù)要求較高，而且易引起毛細胞的自溶而影響試驗結(jié)果。近年來的實驗中逐漸采用不同濃度配比的戊二醛-甲醛混合液固定組織，并且采用心內(nèi)灌注的方法。故本研究采用2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液及文獻有報道的4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液[3~6]，以心內(nèi)灌注的方法分別處死固定大鼠耳蝸，比較兩種方法處理后大鼠耳蝸iNOS的表達和透射電鏡觀察效果。這種固定液心內(nèi)灌注的方法能夠讓固定液在脈管系統(tǒng)內(nèi)快速到達內(nèi)耳組織進行固定，縮短了將實驗動物斷頭、取出聽泡、開放前庭腔注入固定液固定的時間，從而減少組織離體至開始固定的時間對免疫組化結(jié)果的影響，也能達到電鏡標本快速固定的要求。

圖1　各組不同固定液固定后耳蝸、腎臟切片(HE×200)

a 正常組大鼠A組耳蝸；b 模型組大鼠A組耳蝸；c 正常組大鼠A組腎小管；d 正常組大鼠B組耳蝸；e 模型組大鼠B組耳蝸；f 正常組大鼠B組腎小管

圖2　各組耳蝸透射電鏡結(jié)果

a. 正常組大鼠A組耳蝸外毛細胞；b. 模型組大鼠A組耳蝸外毛細胞；c. 正常組大鼠B組耳蝸外毛細胞；d. 模型組大鼠B組耳蝸外毛細胞

iNOS表達在正常大鼠腎臟的腎小管，A、B兩組大鼠腎臟的腎小管均有iNOS表達，表明本實驗結(jié)果可靠，混合固定液可以保存iNOS抗原。有作者采取分子雜交的方法發(fā)現(xiàn)正常耳蝸有iNOS RNA條帶及蛋白條帶的顯色；有報道運用免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)正常耳蝸也有iNOS熒光顯示；這些結(jié)果從RNA和蛋白水平均證明正常大鼠耳蝸組織有iNOS的弱表達，表達位置有毛細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)[9~13]。從文中結(jié)果看，正常組及模型組大鼠耳蝸外毛細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)等部位的細胞胞核棕色深染，正常組大鼠表達強度明顯較模型組弱，與Shi等[1]結(jié)果相似；Shi等在試驗中是采用斷頭處死動物、蝸尖鉆孔后注入多聚甲醛的固定方法，而本研究是使用多聚甲醛-戊二醛配比固定液心內(nèi)灌注的固定方法，說明本研究方法也可以較好地保存iNOS抗原，結(jié)果可靠。文中結(jié)果顯示，A、B兩組電子顯微鏡下內(nèi)耳毛細胞的纖毛等超微結(jié)構(gòu)清晰，胞內(nèi)的細胞器等結(jié)構(gòu)無明顯差異，說明兩種固定液對于耳蝸細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察無明顯差異。但是正常組大鼠及模型組大鼠中A組的HE染色質(zhì)量評分均低于B組，與A組固定液中多聚甲醛濃度偏低，戊二醛濃度偏高有關(guān)；戊二醛穿透性強，它能快速而不可逆地與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，使蛋白凝固從而固定組織，也可以固定和蛋白質(zhì)有關(guān)的或含有氨基和亞氨基的脂類；但無法阻止后面的脫水、滲透和包埋過程對樣品脂類的抽提，因而對細胞膜的固定效果不理想；同時與氨基的不可逆反應(yīng)導(dǎo)致部分抗原封閉進而影響免疫組化的結(jié)果，從而導(dǎo)致A組的免疫組化染色不佳，組織有溶解現(xiàn)象；而B組所用的固定液提高多聚甲醛的濃度后很好地解決了這些問題，故B組免疫組化染色質(zhì)量優(yōu)于A組。

文中結(jié)果表明，采用4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液心內(nèi)灌注固定即能夠較好地保存iNOS抗原,又能夠較好地固定細胞器，從而達到較好的電鏡觀察標本的固定效果，也能達到較滿意的免疫組化染色效果。實驗操作不需要斷頭取出耳蝸分別處理，縮短了取出標本固定的時間，技術(shù)操作簡單易行，值得推廣。

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(2015-04-22收稿)

(本文編輯雷培香)

·實驗研究·

The Effects of Different Fixative on Transmission Electron Microscopy Examination

and Induced Nitric Oxide Synthase Expression in Rat

Chen Xiaowan*, Jiang Ying, Chou Zhiqiang, Zhang Xiaobing

(*Department of Otolaryngology Head and Neck Srugery, The Frist Hospital

of Lanzhou University, Lanzhou, 730000,China)

【Abstract】ObjectiveTo find a more suitable fixative for examining transmission electron microscopy (TEM) and induced nitric oxide synthase(iNOS) measure.MethodsA total of 12 adult male rats (24 ears)with normal hearing were used in this study and randomly divided into control group(6 rats,12 ears) and gentamicin group (6 rats,12 ears). Three rats in each group was fixed with 4%paraform-0.5% glutaraldehyde mixture, the another 3 rats were fixed with 2.5%paraform-2.5% glutaraldehyde mixture. The cochleae were examined by transmission electron microscopy(TEM) to observe ultrastructural changes. In addition, iNOS expression was measured. ResultsThe positive staining of iNOS was observed in the cochlea in all groups. The control groups were weakly positive, while the gentamicin groups were strongly positive. Those tissue sections showed cell dissolved ,uneven dyeing, poor background staining which were fixed with 2.5% paraform-2.5% glutaraldehyde mixture. While there were no significant differences between different fixed groups in TEM results.ConclusionOur resucts indicate that 4%paraform-0.5% glutaraldehyde mixture is better than 2.5%paraform-2.5% glutaraldehyde mixture for fixing rat by heart perfusing for TEM examine and iNOS expression measure.

【Key words】Rat;Induced nitric oxide synthase( iNOS);Transmission electron microscopy(TEM);Fixative;Gentamicin

通訊作者：張小兵(Email:790736924@qq.com)

作者簡介：陳小婉,女,甘肅人,博士研究生,主要研究方向為耳科學(xué)。

【中圖分類號】R764.3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0058-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.015