徐敦明，陳　燕，張　縉，余宇成，馮　峰，張　峰，儲曉剛

(1.廈門出入境檢驗檢疫局　檢驗檢疫技術中心,福建　廈門　361026；2.中國檢驗檢疫科學研究院

食品安全研究所，北京　100123)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定乳品中左旋肉堿含量

徐敦明1*，陳燕1，張縉1，余宇成1，馮峰2，張峰2，儲曉剛2

(1.廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,福建廈門361026；2.中國檢驗檢疫科學研究院

食品安全研究所，北京100123)

摘要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定乳品中左旋肉堿含量的方法。樣品經(jīng)0.1 mol/L HCl溶解，采用乙腈溶液沉淀蛋白，以HILIC色譜柱分離待測物，采用鞘流電噴霧離子化，正離子多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測，內(nèi)標法定量。在3個加標水平下，左旋肉堿的平均加標回收率為85.2%~102.0%，相對標準偏差(RSD,n=6)為7.6%~14.3%，方法檢出限(LOD)為50 μg/kg，定量下限(LOQ)為200 μg/kg。運用該方法對20個乳品樣品中的左旋肉堿含量進行測定，檢出含量為68 ~165 mg/kg，與樣品標簽的符合率達95%。該方法快速、簡便、準確，適用于乳品中左旋肉堿含量的測定。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；左旋肉堿；乳品；內(nèi)標

Determination ofL-Carnitine in Dairy Products by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass SpectrometryXU Dun-ming1*,CHEN Yan1,ZHANG Jin1,YU Yu-cheng1,FENG Feng2,ZHANG Feng2,CHU Xiao-gang2

(1.Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Xiamen361026,China;2.Institute of

Food Safety,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing100123,China)

Abstract：A method of HPLC-MS/MS with internal standard for the determination of L-carnitine in dairy products was developed.After the sample was dissolved in 0.1 mol/L HCl solution and its protein was precipitated with acetonitrile,the object was separated with a HILIC chromatographic column,tested by HPLC-MS/MS with sheath flow electro-spray ionization under positive ion scanning and multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified by the internal standard method.The average recoveries at three spiked levels were in the range of 85.2%-102.0% with RSDs(n=6) of 7.6%-14.3%.The limit of detection (LOD) was 50 μg/kg and the limit of quantitation(LOQ) was 200 μg/kg.The proposed method was applied in the analysis of several real samples of different origins from overseas,and 20 samples were screened for L-carnitine with content range of 68-165 mg/kg,of which only 1 sample did not match with the label.This method was rapid,simple and accurate,and was suitable for the determining of L-carnitine content in dairy products. [3]Zhong X L,Chen J,Yu Y H.Inorg.Anal.s China(鐘新林,陳軍,余彥海.中國無機分析化學),2012,2:71-74.

Key words：HPLC-MS/MS；L-carnitine；dairy products；internal standard

左旋肉堿(L-Carnitine)，又稱卡尼丁或L-肉堿，存在于大多數(shù)哺乳動物組織中，能夠促進脂肪酸向線粒體中傳輸，達到氧化分解脂肪的功效[1]。左旋肉堿不僅在能量產(chǎn)生和脂肪代謝過程中起重要作用，而且在維持嬰兒生命及促進嬰幼兒發(fā)育的某些生理過程，如生酮作用、氮代謝等方面均具有一定的功能。由于嬰兒自身合成左旋肉堿的能力較弱，因此必須通過補充外源性左旋肉堿才能滿足身體需要[2]。目前，世界上已有22個國家允許在嬰兒奶粉中添加左旋肉堿[3]。我國也規(guī)定可在嬰幼兒奶粉中添加適量的左旋肉堿。國家強制性標準GB 14880-2012中規(guī)定左旋肉堿在兒童用調(diào)制乳粉中的添加量為50~150 mg/kg，其它用途調(diào)制乳粉為300~400 mg/kg[4]。GB 10765-2010[5]及 GB 10767-2010[6]中規(guī)定左旋肉堿為可選擇性成分，如需添加，添加量最小值為0.3 mg/100 kJ。

目前，國內(nèi)外已報道的左旋肉堿測定方法主要包括分光光度法[7-9]、免疫法[10-11]、毛細管電泳法[12]、離子色譜法[3,13]、液相色譜法[14-17]以及質(zhì)譜法[2,18]等。但分光光度法需酶解且檢出限高，離子色譜或液相色譜法的特異性差。GB 29989-2013[9]采用分光光度法，干擾大，無法進行確證實驗。文獻報道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]，基質(zhì)效應顯著，影響分析的準確性。為保障消費者權益，加強對奶粉市場的監(jiān)管，建立快速、簡便、可靠、準確的左旋肉堿測定方法十分必要。針對現(xiàn)有方法的缺點，本文建立了特異性強、靈敏度高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定奶粉中的左旋肉堿含量。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀，配Agilent 1290高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Agilent Jet Stream電噴霧離子源(AJS ESI)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；渦旋混勻器；Milli-Q超純水系統(tǒng)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)，甲酸(色譜純,Fisher公司)，氨水(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，濃鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)。標準物質(zhì)：左旋肉堿和左旋肉堿(d3)內(nèi)標物(純度均大于98%，德國Dr.Ehrensterfer公司)。

稱取適量標準品，用乙腈-水(90∶10)溶液配成1 000 mg/L的儲備液，儲存于0~4 ℃冰箱。根據(jù)實驗需要，用乙腈-水(90∶10)溶液稀釋標準儲備液，配成適當濃度的標準工作溶液。

SPE小柱(3 mL,60 mg,Waters公司)：WCX(混合型弱陽離子交換柱)、HLB(親水親脂小柱)、MCX(混合型陽離子交換柱)。

1.2樣品前處理

1.2.1提取稱取1.00 g(精確至0.01 g)乳品樣品于250 mL三角瓶中，加入100 μg左旋肉堿(d3)內(nèi)標液、30 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，渦旋振蕩1 min，超聲提取15 min后，移入100 mL容量瓶中，用10 mL 0.1 mol/L HCl分2次涮洗三角瓶，洗滌液移入容量瓶中，以0.1 mol/L HCl定容至100 mL，取1 mL提取液于20 mL試管中，加入9 mL乙腈溶液，渦旋混勻1 min后取部分于5 mL離心管，16 000 r/min離心5 min，所得上清液待凈化。

1.2.2SPE凈化強陽離子交換柱分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 10 mmol/L 的鹽酸水溶液進行活化，移取1 mL上述上清液以1滴/秒的速度過柱，完成后用3 mL 10 mmol/L 的鹽酸水溶液淋洗，最后用2 mL 4%氨水甲醇溶液洗脫。洗脫液于40 ℃經(jīng)氮吹至近干后，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，過濾膜后，供測定。

表1　左旋肉堿及其內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion；CE：collision energy；F：fragmentor voltage

1.2.3LC-MS/MS條件色譜柱：Agilent HILIC(100 mm× 2.1 mm,3.5 μm)。流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；洗脫梯度程序：0 ~2.0 min，90%B，2.01 ~6.0 min，90%~45%B，6.01 ~10.0 min，45%~90%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。采用AJS ESI源，正離子多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測。霧化氣壓力：310.3 kPa；噴嘴電壓：500 V；干燥氣：溫度300 ℃，流速10 L/min；鞘氣：溫度325 ℃，流速8 L/min；毛細管電壓：3 500 V。左旋肉堿及其內(nèi)標物的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)見表1。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用目標化合物標準溶液，優(yōu)化左旋肉堿及其內(nèi)標物的質(zhì)譜條件。在Scan模式下，化合物進入一級質(zhì)譜后，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子，并確定為化合物母離子；在SIM模式下，對化合物的碎裂電壓進行優(yōu)化；母離子進入二級質(zhì)譜，將發(fā)生斷裂或重排等反應產(chǎn)生不同的離子碎片；在Product ion 模式下，對化合物母離子施加一定的碰撞能量后，得到其相應的離子碎片；最后在MRM模式下，優(yōu)化目標物離子碎片的最佳碰撞能量。左旋肉堿及其內(nèi)標物的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1，圖1為左旋肉堿及其內(nèi)標物的總離子流圖和MRM色譜圖。

2.2色譜條件的優(yōu)化

通過結(jié)構與性質(zhì)分析，可知左旋肉堿屬于極性較強的化合物，因此，在反相色譜柱上很難被保留，若使用C18等反相色譜柱，通常需加入離子對試劑，但該操作繁瑣、試劑用量大且易污染儀器。而正相色譜柱對強極性物質(zhì)有較好的保留。本研究比較了C18色譜柱和HILIC色譜柱對左旋肉堿的保留效果，結(jié)果顯示，C18色譜柱對目標化合物的保留效果差，約1.4 min出峰，而HILIC柱的保留能力較強，約3.7 min出峰。因此，本實驗選用Agilent-HILIC(100 mm × 2.1 mm,3.5 μm)作為分離色譜柱。

目標化合物采用MRM正離子掃描模式，有機相常選用乙腈溶液，水相通常使用甲酸水、乙酸銨溶液或兩者混合溶液。通過對比發(fā)現(xiàn)，選用0.1%甲酸水溶液作為水相時，目標化合物的靈敏度與分離效果最好,參考保留時間為3.65 min,標準溶液色譜圖見圖1A。因此，實驗選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

2.3樣品前處理優(yōu)化

左旋肉堿屬于極性較強的化合物，因此水可作為其提取溶劑。然而，乳品中含有蛋白質(zhì)等大量的化合物，若直接用水提取，雜質(zhì)將一并被提取出，影響左旋肉堿在質(zhì)譜中的離子化效率，從而影響分析測定的準確性。本文選用0.1 mol/L HCl溶液作為提取溶劑，既可以除去部分雜質(zhì)，也可以促使左旋肉堿以游離狀態(tài)溶于溶液中，超聲15 min，可使左旋肉堿被充分提取。

實驗發(fā)現(xiàn)乳品中含有大量的干擾物質(zhì)，基質(zhì)效應明顯，對分析目標物的抑制作用顯著。比較了不同固相萃取柱對樣品回收率的影響，結(jié)果表明，左旋肉堿在WCX與HLB柱中會隨淋洗液流失，目標化合物在淋洗液中有檢出。采用MCX柱時，左旋肉堿的回收率大于80%，因此選用MCX柱進行后續(xù)實驗。將本方法的加標回收率與竺琴等[2]報道的方法進行比較。結(jié)果表明，兩種前處理方法的測定值差距較大，可達10倍差距。分析其原因，主要是由于基質(zhì)效應引起。實際樣品測定及加標回收實驗結(jié)果表明，本文前處理方法的測定值更符合標簽值或?qū)嶒炋砑恿俊?/p>

進一步比較了甲醇-水(1∶1,含75 mmol/L吡啶)和4%氨水甲醇的洗脫效果，結(jié)果表明，采用4%氨水甲醇進行洗脫時的回收率較甲醇水洗脫時高。同時比較了乙腈、乙腈-水、0.1%甲酸水、甲醇和4%氨水甲醇作為定容溶劑的影響，結(jié)果顯示，選用0.1%甲酸水作為定容溶劑時，質(zhì)譜響應更好，峰形更佳。因此，本方法選用4%氨水甲醇作為洗脫溶劑，0.1%甲酸水作為定容溶劑。

2.4線性范圍、檢出限與定量下限

在優(yōu)化條件下，用乙腈-水(90∶10)溶液將標準儲備液稀釋成濃度分別為0.200，0.500，1.00，5.00，20.0，50.0，100，200 mg/L的系列左旋肉堿及其內(nèi)標物(0.1 mg/L)標準混合溶液，采用本方法進行HPLC-MS/MS分析。以進樣濃度為橫坐標(x，mg/L)，定量離子對的峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線。結(jié)果表明，左旋肉堿及其內(nèi)標物在0.200~200 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，左旋肉堿的線性方程為y=2 413x- 1 778，相關系數(shù)為0.999 7。通過在不含左旋肉堿的乳品樣中添加標準品，按本方法進行測定，以信噪比S/N=3計算檢出限(LOD),信噪比S/N=10計算定量下限(LOQ)，得到左旋肉堿的LOD為50 μg/kg，LOQ為200 μg/kg。

2.5準確度與精密度

取3種不同的乳品樣品，按照本方法測定左旋肉堿本底含量后，向樣品中加入標準品，使樣品扣除本底外左旋肉堿的含量分別為40，60，80 mg/kg，平行測定6次，計算加標回收率及相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表2。左旋肉堿的平均加標回收率為85.2%~102.0%，RSD為7.6%~14.3%。表明本方法準確度高，重復性好，能夠滿足乳品樣品中左旋肉堿含量的測定要求。

表2　左旋肉堿的平均回收率與精密度(n=6)

2.6實際樣品的檢測

采用本文建立的方法，對20個實際乳品樣品中的左旋肉堿含量進行測定，檢出含量為68 ~165 mg/kg，與樣品標簽的符合率達95%(見表3)。1個實際樣品中左旋肉堿的總離子流圖見圖2。

3結(jié)論

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定了乳品中的左旋肉堿含量。使用0.1 mol/L HCl溶液對樣品進行提取，采用乙腈溶液沉淀蛋白，通過MCX小柱對樣品進行凈化后，以HILIC色譜柱分離，選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相洗脫，采用鞘流電噴霧離子化，MRM模式檢測，內(nèi)標法定量。在最佳條件下，左旋肉堿的平均加標回收率為85.2%~102.0%，RSD為7.6%~14.3%，方法的LOD為50 μg/kg，LOQ為200 μg/kg。使用該方法對20個實際乳品樣品中的左旋肉堿含量進行測定，檢出量為68 ~165 mg/kg，與樣品標簽的符合率達95%。該方法快速、簡便、準確，適用于乳品中左旋肉堿含量的測定。

表3　20種實際樣品中左旋肉堿的標簽值與測定值

*no matching with the label

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中圖分類號：O657.63

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0096-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.016

通訊作者：*徐敦明，博士，研究員，研究方向：食品安全研究與檢測,Tel:0592-3269935,E-mail:Xudm@xmciq.gov.cn

基金項目：質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項項目(2012104002)；行業(yè)標準項目(2014B087)

收稿日期：2015-06-04；修回日期：2015-08-05