李　健，陳耀星，陳福寧，王子旭，曹　靜，董玉蘭

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471003； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3.北京昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 102208)

?

MAPK信號通路在炔雌醚誘導(dǎo)大鼠生精細(xì)胞凋亡中的作用研究

李健1*，陳耀星2，陳福寧3，王子旭2，曹靜2，董玉蘭2

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471003； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3.北京昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 102208)

摘要：旨在探討MAPK信號通路在炔雌醚誘導(dǎo)大鼠生精細(xì)胞凋亡中的作用。將20只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按體重分別以0.00、0.01、0.10、1.00 mg·kg-1腹腔注射溶解于橄欖油的炔雌醚，50 μL·只-1，每天1次，連續(xù)1周。處理結(jié)束后，取睪丸并制備組織切片，通過HE染色觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)的變化；通過免疫組織化學(xué)方法檢測睪丸生精細(xì)胞PCNA、MAPK信號通路磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化P38(p-P38)蛋白表達(dá)，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，炔雌醚處理后大鼠睪丸曲細(xì)精管上皮厚度下降，各級生精細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞皺縮，間隙增大，結(jié)構(gòu)松散，管腔內(nèi)成熟精子數(shù)量減少。生精細(xì)胞PCNA與p-ERK蛋白表達(dá)顯著減少；TUNEL、p-JNK蛋白及p-P38蛋白表達(dá)則顯著增加。綜上表明，炔雌醚暴露通過影響MAPK信號傳導(dǎo)通路抑制生精細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終抑制大鼠睪丸發(fā)育。

關(guān)鍵詞：MAPK信號通路；PCNA；炔雌醚；生精細(xì)胞；凋亡

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡等途徑造成一系列的生殖功能紊亂，如改變下丘腦氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)濃度、減少肛殖距及間質(zhì)細(xì)胞功能異常等[1-3]；但是，其造成雄性動物生殖疾病的分子機(jī)制尚未完全明確。近年來的研究熱點(diǎn)發(fā)現(xiàn)MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常的生理和疾病過程中均發(fā)揮至關(guān)重要的作用，如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[4]、神經(jīng)退行性病變、疼痛[5]及腦炎癥[6]等疾病。MAPK絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號通路主要分為3大類，即細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)和P38激酶通路。MAPKs信號通路能被化學(xué)物質(zhì)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)及激素等細(xì)胞內(nèi)外的因素激活，發(fā)生磷酸化作用。短暫激活ERKs促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖，持續(xù)激活ERKs促進(jìn)細(xì)胞的分化；而短暫激活JNKs促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，持續(xù)激活促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；P38激活下游分子原癌基因c-myc與核因子-κB(NF-κB)，促進(jìn)細(xì)胞死亡。激活的MAPKs通路促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、促進(jìn)凋亡蛋白Bax表達(dá)，并刺激細(xì)胞色素C的釋放，最終上調(diào)Caspase-3、8、9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-9]。而關(guān)于炔雌醚對大鼠睪丸生精細(xì)胞MAPK信號傳導(dǎo)通路的影響尚未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)將對有關(guān)MAPK信號傳導(dǎo)通路在炔雌醚誘發(fā)成年大鼠生精異常過程中的作用進(jìn)行研究，旨在揭示MAPK信號傳導(dǎo)通路在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物誘發(fā)生精異常的深層作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動物處理

8周齡雄性封閉群SD大鼠(河南省實(shí)驗(yàn)動物中心)。平均體重(240±20) g，自由采食、飲水，在每天14 h光照，10 h黑暗的條件下進(jìn)行飼喂。將20只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按體重分別以0.00、0.01、0.10、1.00 mg·kg-1腹腔注射溶解于橄欖油的炔雌醚，50 μL·只-1，每天1次，連續(xù)1周。

1.2試劑

炔雌醚購自北京紫竹藥業(yè)有限公司；橄欖油購自國藥集團(tuán)；PCNA、TUNEL檢測試劑盒、磷酸化ERK、JNK、P38檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3TUNEL法檢測睪丸原位細(xì)胞凋亡

睪丸生精細(xì)胞凋亡檢測按試劑盒說明進(jìn)行，步驟：切片常規(guī)脫蠟至水，蛋白酶K室溫孵育30 min后，PBS沖洗，擦干樣品周圍的PBS；3% H2O2室溫孵育30 min，PBS沖洗；滴加TUNEL反應(yīng)混合液(DNA末端轉(zhuǎn)移酶與含dNTP混合液的反應(yīng)液)，在濕盒中，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗；滴加轉(zhuǎn)化劑POD(酶標(biāo)記抗熒光素抗體)，37 ℃孵育30 min，PBS(pH7.4)沖洗；滴加DAB底物溶液孵育5 min左右，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

1.4免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色檢測PCNA、磷酸化ERK(p-ERK)、JNK(p-JNK)及P38(p-P38)表達(dá)。免疫組化 LAB 法染色步驟：石蠟切片常規(guī)二甲苯脫臘，梯度酒精入水；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min；將組織切片用100%甲醇配制的3% H2O2封閉，室溫下30 min；微波抗原修復(fù)10 min，取出后自然冷卻至室溫；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次 10 min；5% 正常山羊血漿(用 0.01 mol·L-1PBS 配制)室溫下30 min；加入一抗兔抗 Caspase-3(1∶100)抗體，4 ℃ 孵育過夜；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min；生物素標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶200，用 0.01 mol·L-1PBS 配制)，室溫孵育2 h；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次 10 min；三抗，室溫下1.5～2.0 h；0.05 mol·L-1Tris-HCl buffer(pH 7.2)漂洗2次，10 min以上；DAB 孵育：0.05 mol·L-1Tris-HCl 配制0.05%的 DAB 孵育液，孵育 20 min；DAB 顯色：0.05% DAB/H2O2，呈色2～10 min；0.05 mol·L-1Tris-HCl buffer(pH 7.2)漂洗3次，每次 10 min；脫水，透明，封片。

分別設(shè)置陰性對照，對照組與試驗(yàn)組同時按上述步驟處理，用 PBS代替一抗，其它步驟完全相同。上述所有孵育過程均在濕盒中進(jìn)行。TUNEL檢測和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果描述：弱陽性(淺棕色)和強(qiáng)陽性(深棕色)。TUNEL法檢測與免疫組織化學(xué)染色的陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分別在各組大鼠睪丸切片上進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)1 000個生精細(xì)胞(包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞)中陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用SPSS18軟件包進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)，以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1炔雌醚對睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1和表1顯示，與對照組相比，0.01、0.10 mg·kg-1炔雌醚組睪丸組織結(jié)構(gòu)無明顯變化；曲細(xì)精管生精上皮充實(shí)，各級生精細(xì)胞數(shù)量多，排列整齊，緊密有序，管腔內(nèi)有大量精子。1.00 mg·kg-1炔雌醚處理后，大鼠睪丸有一定程度的萎縮，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；較多曲細(xì)精管生精上皮生精細(xì)胞數(shù)量明顯下降，排列松散而紊亂，管腔內(nèi)沒有或少見成熟的精子。

2.2炔雌醚對生精細(xì)胞增殖與凋亡的影響

如圖2和表1所示，PCNA表達(dá)呈棕黃色，分布在多種生精細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。與對照組相比，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量無顯著變化。1.00 mg·kg-1炔雌醚組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量下降49.35%，差異極顯著(P<0.01)。TUNEL表達(dá)呈棕黃色，分布在凋亡生精細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。對照組和0.01 mg·kg-1組TUNEL表達(dá)細(xì)胞數(shù)量較少，0.10 mg·kg-1組TUNEL表達(dá)細(xì)胞數(shù)量有增加趨勢，但不顯著。1.00 mg·kg-1炔雌醚組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加了120.68%(P<0.01)。

表1炔雌醚對大鼠睪丸重量、生精細(xì)胞增殖與凋亡的影響

Table 1Effects of quinestrol on weight of testes，proliferation and apoptosis of spermatogenic cell in rats

**P<0.01表示與對照組相比差異極顯著，下同。生精細(xì)胞的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的PCNA和TUNEL陽性細(xì)胞通過睪丸免疫組化切片的1 000個細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

**P<0.01 compared with the control andP<0.01 were considered statistically significant.The same as below.The numbers of cells positive for PCNA and TUNEL were determined by counting 1 000 spermatogenic cells (spermatogonia，spermatocytes，sperm cells and Leydig cells) from ST cross-sections with immunohistochemistry staining

2.3炔雌醚對大鼠睪丸生精細(xì)胞p-ERK、p-JNK和p-P38 表達(dá)的影響

圖3和表2表明，在對照組、0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組，磷酸化ERK(p-ERK)主要表達(dá)在精原細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。與對照組相比，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組p-ERK表達(dá)細(xì)胞數(shù)量無顯著變化。1.00 mg·kg-1炔雌醚組p-ERK表達(dá)在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核。細(xì)胞數(shù)量下降了54.7%(P<0.01)。與對照組相比，各試驗(yàn)組p-JNK表達(dá)在精原細(xì)胞的細(xì)胞核，呈增加趨勢，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。1.00 mg·kg-1炔雌醚組p-JNK在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均有表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增加了44.74%(P<0.01)。與對照組相比，各試驗(yàn)組p-P38表達(dá)呈增加趨勢，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組主要表達(dá)在細(xì)胞核，增加數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。1.00 mg·kg-1炔雌醚組p-JNK在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核均有表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增加了81.6%(P<0.01)。

表2炔雌醚對大鼠睪丸生精細(xì)胞p-ERK、p-JNK和p-P38 表達(dá)的影響

Table 2Effects of quinestrol on p-ERK，p-JNK and p-P38 of spermatogenic cell in rats

生精細(xì)胞的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的p-ERK，p-JNK和p-P38 陽性表達(dá)通過在睪丸免疫組化切片的計(jì)數(shù)1 000個生精細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

The numbers of cells positive for p-ERK，p-JNK and p-P38 were determined by counting 1 000 spermatogenic cells (spermatogonia，spermatocytes，sperm cells and Leydig cells) from ST cross-sections with immunohistochemistry staining

3討論

化學(xué)合成藥物炔雌醚作為嚙齒類動物不育劑，廣泛地用于控制鼠類種群數(shù)量[11-12]。炔雌醚通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、抑制生精細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)及抑制生殖激素分泌等途徑抑制雄性生殖器官睪丸、附睪、精囊腺及前列腺發(fā)育，降低雄性生殖功能[13]。但是，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物造成雄性動物生殖疾病的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討。MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常的生理和疾病過程中均發(fā)揮重要的作用，短暫激活的ERKs促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖，持續(xù)的激活ERKs促進(jìn)細(xì)胞的分化；而JNKs短暫激活促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，持續(xù)的激活通過促進(jìn) P53、Bax、Fasl、TNF 及caspase-3等促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；P38通過激活下游分子原癌基因c-myc表達(dá)、磷酸化 P53參與 Fas/Fasl 介導(dǎo)的凋亡、激活 c-jun 和 c-fos表達(dá)，誘導(dǎo) Bax 轉(zhuǎn)位以及增強(qiáng) TNF-α表達(dá)等多種途徑促進(jìn)細(xì)胞死亡。而且，MAPK通路中的3個成員ERK1/2、JNK和 P38通路均參與調(diào)節(jié)包括睪酮和雌二醇在內(nèi)的多種生殖激素合成[14-16]，而激素合成在生精細(xì)胞的發(fā)育與增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，因此，MAPK通路可能與激素水平異常造成的生殖疾病密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，7 d連續(xù)炔雌醚暴露造成大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)紊亂，表達(dá)PCNA的生精細(xì)胞數(shù)量減少；同時，表達(dá)磷酸化ERK蛋白的生精細(xì)胞數(shù)量明顯下降。B.Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，HSP90抑制劑17-去甲氧基-17-烯丙基氨基格爾德霉素(17-AAG)通過抑制ERK，增強(qiáng)棉酚對Bcl-2表達(dá)的抑制。前期研究發(fā)現(xiàn)炔雌醚處理抑制生精細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，而ERK磷酸化的抑制可下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，表明炔雌醚可能通過抑制ERK的磷酸化減少細(xì)胞增殖[10，18]。柳海燕等[19]通過激活ERK MAPK途徑來調(diào)節(jié)3B-羥基類固醇脫氫酶(3B-HSD)，進(jìn)而促進(jìn)睪酮的合成。A.Santillo等[20]采用D-天冬氨酸激活大鼠精原細(xì)胞ERK磷酸化，上調(diào)雄激素受體表達(dá)，促進(jìn)睪酮合成與分泌。前期研究發(fā)現(xiàn)，炔雌醚處理造成睪丸睪酮激素分泌的下降，因此，炔雌醚很可能通過抑制ERK MAPK途徑阻礙睪丸睪酮激素的分泌，而睪酮的下降又進(jìn)一步影響性激素依賴的睪丸、附睪、精囊腺及前列腺發(fā)育，并促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡。與PCNA表達(dá)相反，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加；同時，與ERK的磷酸化下降不同，JNK與P38的磷酸化均顯著升高。前期研究發(fā)現(xiàn)炔雌醚促進(jìn)Bax、Fas/FasL及P53的表達(dá)，表明炔雌醚通過激活JNK與P38的磷酸化促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。J.Liu等[21]發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸通過激活ROS氧化應(yīng)激、JNK及P38 MAPK信號通路促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬和凋亡。S.Qi等[22]研究證實(shí)，雙酚A通過激活JNK和P38 MPAK信號通路，激活Fas/FasL系統(tǒng)促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞的凋亡。因此，炔雌醚通過直接抑制ERK MAPK途徑、激活JNK和P38 MAPK途徑抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而睪酮含量下降又間接抑制睪丸發(fā)育，最終促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡。

綜上表明，本研究通過炔雌醚處理大鼠試驗(yàn)探討炔雌醚對睪丸MAPK信號通路的作用，初步論證MAPK在大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡中的作用。首次發(fā)現(xiàn)炔雌醚通過抑制ERK磷酸化降低PCNA的表達(dá)，從而抑制生精細(xì)胞增殖；并通過激活JNK和P38磷酸化增加TUNEL的表達(dá)，從而促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡。對生殖系統(tǒng)的MAPK信號通路進(jìn)行深入的研究，有利于揭示生殖系統(tǒng)疾病的深層病理機(jī)制，從而為其防治尋找新的治療途徑提供參考。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]LI J，WANG Z X，SHI D Z，et al.Adult exposure to sasanguasaponin induces spermatogenic apoptosis in vivo through increased oxidative stress in male mice[J].ToxicolIndHealth，2010，26(10)：691-700.

[2]WHITE R E，GERRITY R，BARMAN S A，et al.Estrogen and oxidative stress：A novel mechanism that may increase the risk for cardiovascular disease in women[J].Steroids，2010，75(11)：788-793.

[3]CARBONE S，SAMANIEGO Y A，CUTRERA R，et al.Different effects by sex on hypothalamic-pituitary axis of prepubertal offspring rats produced by in utero and lactational exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)[J].NeuroToxicol，2012，33(1)：78-84.

[4]MOUSA A，BAKHIET M.Role of cytokine signaling during nervous system development[J].IntJMolSci，2013，14：13931-13957.

[5]JI R R，GEREAU Ⅳ R W，MALCANGIO M，et al.MAP kinase and pain[J].BrainResRev，2009，60(1)：135-148.

[6]KAMINSKA B，GOZDZ A，ZAWADZKA M，et al.MAPK signal transduction underlying brain inflammation and gliosis as therapeutic target[J].AnatRec(Hoboken)，2009，292：1902-1913.

[7]WANG X，ZHU G，YANG S，et al.Paeonol prevents excitotoxicity in rat pheochromocytoma PC12 cells via downregulation of ERK activation and inhibition of apoptosis[J].PlantaMed，2011，77(15)：1695-701.

[8]WANG Y，WANG S C，LUO X，et al.The roles of DNA damage-dependent signals and MAPK cascades in tributyltin-induced spermatogenicline apoptosis in Caenorhabditis elegans[J].Chemosphere，2014，108：231-238.

[9]MALIK S，SUCHAL K，GAMAD N，et al.Telmisartan ameliorates cisplatin-induced nephrotoxicity by inhibiting MAPK mediated inflammation and apoptosis[J].EurJPharmacol，2015，748：54-60.

[10]王濤濤，郭永旺，王登，等．炔雌醚對布氏田鼠繁殖的抑制效果[J]．獸類學(xué)報(bào)，2015，35 (1)：87-94．

WANG T T，GUO Y W，WANG D，et al.Suppression effects of quinestrol on the reproduction of Brandt’s voles (Lasiopodomysbrandtii)[J].ActaTheriologicaSinica，2015，35 (1)：87-94．(in Chinese)

[11]SHEN W，SHI D，WANG D，et al.Inhibitive effects of quinestrol on male testes in Mongolian gerbils (Merionesunguiculatus)[J].ResVetSci，2012，93：907-913.

[12]LV X，GUO Y，SHI D.Effects of quinestrol on reproductive hormone expression，secretion，and receptor levels in female Mongolian gerbils (Merionesunguiculatus)[J].Theriogenology，2012，77：1223-1231.

[13]LI J，CHEN F N，CHEN Y X，et al.Mitochondrial- and Fas-L-mediated pathways involved in quinestrol induced spermatogenic apoptosis in adult rat testes[J].ToxicolMechMethod，2014，24(9)：609-615.

[14]OTIS M，GALLO-PAYET N.Role ofMAPKs in angiotensin II-induced steroidogenesis in rat glomerulosa cells[J].MolCellEndocrinol，2007，(265-266)：126-130.

[15]MANNA P R，STOCCO D M.The role of specific mitogen-activated protein kinase signaling cascades in the regulation of steroidogenesis[J].JSignalTransduct，2011，http：//dx.doi.org/10.1155/2011/821615 (Article ID 821615，13 pages).

[16]SOKANOVIC S J，JANJIC M M，STOJKOV N J，et al.Age related changes of cAMP and MAPK signaling in Leydig cells of Wistar rats[J].ExpGerontol，2014，58：19-29.

[17]WANG B，CHEN L，NI Z.Hsp90 inhibitor 17-AAG sensitizes Bcl-2 inhibitor (-)-gossypol by suppressing ERK-mediated protective autophagy and Mcl-1 accumulation in hepatocellular carcinoma cells[J].ExpCellRes，2014，328：379-387.

[18]王倩，鄒健，張秀芬，等.GCS 通過 MEK / ERK 通路調(diào)控白血病多藥耐藥細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 bcl-2 的表達(dá)[J].中國病理生理雜志，2015，31(1)：114-118.

WANG Q，ZOU J，ZHANG X F，et al.Glucosylceramide synthase upregulates apoptosis-related gene expression MEK/ERK signaling pathway in leukemia multidrug-resistant cell line[J].ChineseJournalofPathophysiology，2015，31(1)：114-118.(in Chinese)

[19]柳海燕，時姍姍，陶曉倩，等.促性腺激素釋放激素激動劑通過ERK MAPK途徑調(diào)控大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞3B-HSD mRNA表達(dá)[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22(8)：789-793.

LIU H Y，SHI S S，TAO X Q，et al.GnRH agonistregulates 3β-HSD mRNA expression via ERK MAPK pathway in rat Leydig cells[J].JournalofMedicalPostgraduates，2009，22(8)：789-793.(in Chinese)

[20]SANTILLO A，F(xiàn)ALVO S，CHIEFFI P，et al.D-aspartate affects NMDA receptor-extracellular signal-regulated kinase pathway and upregulates androgen receptor expression in the rat testis[J].Theriogenology，2014.81(5)：744-751.

[21]LIU J，CHANG F，LI F，et al.Palmitate promotes autophagy and apoptosis through ROS-dependent JNK and P38 MAPK[J].BiochemBiophysResCommun，2015，463：262-267.

[22]QI S，F(xiàn)U W，WANG C，et al.BPA-induced apoptosis of rat Sertoli cells through Fas/FasL and JNKs/P38 MAPK pathways[J].ReprodToxicol，2014，50：108-116.

(編輯程金華)

The Role of MAPK Signaling Pathway in Quinestrol-induced Apoptosis of Spermatogenic Cells in Rat

LI Jian1*，CHEN Yao-xing2，CHEN Fu-ning3，WANG Zi-xu2，CAO Jing2，DONG Yu-lan2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LaboratoryofVeterinaryAnatomy，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；3.ChangpingHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine，Changping，Beijing102208，China)

Key words:MAPK signaling pathway；PCNA；quinestrol；spermatogenic cells；apoptosis

Abstract:This experiment was conducted to study the role of MAPK signaling pathway in quinestrol-induced apoptosis of spermatogenic cells in rat.Twenty 8-week-old male SD rats were randomly divided into 4 groups and were treated by using daily intraperitoneal injection of 0.00，0.01，0.10 and 1.00 mg·kg-1of BW quinestrol dissolved in olive oil for 1 week after 1-week adaptive feeding.At the end of the treatment，the testis tissue sections were prepared and the morphology of the testis tissue was observed by HE staining.The immunohistochemistry staining was performed to measure the expression levels of PCNA，MAPK signaling pathway of p-ERK，p-JNK and p-P38 in spermatogenic cells and TUNEL method was used to detect apoptosis of spermatogenic cells.The results showed that the epithelial thickness of rat seminiferous tube decreased as well as the number of spermatogenic cells decreased.Numerous spermatocytes and spermatids showed swelling or shrinkage and meanwhile the number of mature sperm reduced in the lumen after quinestrol exposure.The expressions of PCNA and p-ERK in the spermatogenic cells were significantly decreased.In contrast，the expressions of TUNEL，p-JNK protein and p-P38 protein were significantly increased.The results suggest that quinestrol exposure inhibited the development of rat testis by inhibiting proliferation and promoting MAPK-mediated apoptosis of spermatogenic cells.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.023

收稿日期：2015-09-08

基金項(xiàng)目：河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃(16A230004)；河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2015QN032)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310464065)

作者簡介：李健(1980-)，男，安徽亳州人，博士，副教授，主要從事生殖毒理學(xué)、動物解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教學(xué)與研究 *通信作者：李健，E-mail：lijian800702@126.com

中圖分類號：S865.1+2.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0381-07