李　凱，高　立，祁小樂，高宏雷，高玉龍，王永強(qiáng)，王笑梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，禽免疫抑制病研究團(tuán)隊(duì)，哈爾濱 150001)

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禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染對(duì)SPF雞免疫器官和疫苗免疫效果的影響

李凱，高立，祁小樂，高宏雷，高玉龍，王永強(qiáng)，王笑梅*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，禽免疫抑制病研究團(tuán)隊(duì)，哈爾濱 150001)

摘要：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)是禽類的一種重要免疫抑制性疾病，目前對(duì)其造成免疫抑制的機(jī)制尚不十分清楚。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株REV流行毒株(HLJR0901株)感染1日齡SPF雞后對(duì)感染雞免疫器官和免疫功能造成的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，1日齡SPF雞感染REV后出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩，法氏囊、胸腺萎縮，脾腫大的癥狀。感染雞出現(xiàn)法氏囊濾泡淋巴細(xì)胞大量壞死減少，間質(zhì)結(jié)締組織增生；胸腺出血，胸腺小體增多；脾小結(jié)明顯萎縮，淋巴細(xì)胞減少等病理變化。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病毒在感染雞法氏囊、胸腺和脾內(nèi)均有分布，且持續(xù)存在。SPF雞感染REV后出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫抑制，使AIV滅活疫苗和NDV弱毒疫苗的免疫效果顯著下降。本研究為闡明REV的免疫抑制機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病；致病性；免疫器官；免疫抑制

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(reticuloendotheliosis，RE)是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)群的反轉(zhuǎn)錄病毒引起的雞、鴨、火雞和其他禽類的一群病理綜合征[1-2]。近年來，REV已在全球范圍內(nèi)流行，國(guó)內(nèi)雞群中REV的感染也非常嚴(yán)重，分布日益廣泛[3-5]。其中，在出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)的雞群REV的檢出率要比正常雞群高很多。本實(shí)驗(yàn)室在之前研究中成功在黑龍江省分離到一株REV流行毒株——HLJR0901株[6]。該毒株除與中國(guó)早期分離株HA9901親緣關(guān)系較遠(yuǎn)外，與中國(guó)其他分離株、美國(guó)分離株以及從污染疫苗中分離的REV毒株均具有很高的同源性[7]。本研究對(duì)1日齡SPF雞以不同劑量人工感染REV(HLJR0901株)，通過對(duì)感染雞生長(zhǎng)發(fā)育、免疫器官、免疫功能以及體內(nèi)病毒分布進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)分析了REV早期感染造成的影響，為REV引起的免疫抑制機(jī)制的研究提供了重要的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

REV HLJR0901株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；SPF雞購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑

Hot Start ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，組織DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，引物和探針由Invitrogen公司合成。

1.3REV感染試驗(yàn)

取1日齡SPF雞120只，分為3組，每組40只。組1攻毒REV HLJR0901株102TCID50·只-1，組2攻毒REV HLJR0901株104TCID50·只-1，組3為PBS對(duì)照組。攻毒途徑為腹腔注射，0.1 mL·只-1。試驗(yàn)前采血檢測(cè)REV抗體滴度。攻毒后每周每組取5只雞，稱重，剖檢并采集法氏囊、胸腺、脾，稱取各器官重量，計(jì)算器官指數(shù)。器官體重比=(器官重量/體重)×1 000；器官指數(shù)=試驗(yàn)組雞的器官體重比/對(duì)照組雞器官體重比的平均值。當(dāng)器官指數(shù)≥1.3時(shí)判為該器官腫大，器官指數(shù)≤0.7時(shí)判為萎縮，0.7<器官指數(shù)<1.3時(shí)判為此器官無明顯變化。采集的各器官分為兩部分，一部分用于檢測(cè)病理變化，另一部分保存于-70 ℃，用于DNA提取和病毒載量檢測(cè)。

1.4免疫抑制試驗(yàn)

取1日齡SPF雞60只，分為3組，每組20只。組1攻毒REV HLJR0901株102TCID50·只-1，組2攻毒REV HLJR0901株104TCID50·只-1，組3為PBS對(duì)照組。攻毒后感染雞分別于7日齡、21日齡免疫NDV LaSota弱毒疫苗(購自哈爾濱維科公司)，于14日齡免疫AIV H5滅活疫苗(購自哈爾濱維科公司)，根據(jù)說明書劑量和操作進(jìn)行。免疫后各周采血，檢測(cè)NDV和AIV HI抗體效價(jià)，直到免疫后8周。

1.5病理變化

采集的各組織經(jīng)固定和石蠟包埋后制作病理切片，HE染色鏡檢，觀察組織病理學(xué)變化。根據(jù)各器官病理變化的不同程度，對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)打分：0，沒有任何病變；1，散在的或部分濾泡病變；2，小于或等于25%的細(xì)胞發(fā)生病變；3，小于或等于50%的細(xì)胞發(fā)生病變；4，50%～75%的細(xì)胞發(fā)生病變；5，75%～100%的細(xì)胞發(fā)生病變。每周對(duì)每個(gè)試驗(yàn)組采集的5只試驗(yàn)雞的法氏囊、胸腺、脾分別制備切片觀察、打分，最后統(tǒng)計(jì)每周各器官病變的平均值。

1.6病毒載量測(cè)定

提取組織DNA，用本實(shí)驗(yàn)室建立的Real-time PCR方法檢測(cè)各試驗(yàn)組雞各器官的病毒載量[8]。對(duì)于每一份提取DNA樣品，同時(shí)檢測(cè)gp90目的基因和β-actin內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，所得結(jié)果換算為每克組織中所含有的病毒載量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1REV感染對(duì)SPF雞體重和器官指數(shù)的影響

1日齡SPF雞感染REV后，從第2周開始表現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩的癥狀，而且日趨明顯，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；104TCID50感染組雞在第4、6、7、8周體重均低于102TCID50感染組，差異顯著(P<0.05)。與對(duì)照組相比，感染雞從第2周開始法氏囊出現(xiàn)明顯萎縮，104TCID50感染組自第5周開始法氏囊指數(shù)顯著低于102TCID50感染組(P<0.05)。胸腺于感染后1周出現(xiàn)腫大癥狀，第2周開始呈現(xiàn)明顯萎縮(P<0.05)，104TCID50組自第6周開始胸腺指數(shù)顯著低于102TCID50組(P<0.05)。脾于感染后第2周開始出現(xiàn)腫大癥狀(P<0.05)，不同劑量組之間差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

2.2REV感染對(duì)SPF雞的病理損傷

如圖2所示，102TCID50感染組法氏囊實(shí)質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞出現(xiàn)輕度減少；胸腺局部出血、輕度淤血、髓質(zhì)內(nèi)的胸腺小體擴(kuò)張、內(nèi)有均質(zhì)嗜酸性染色的崩解產(chǎn)物(箭頭所示)；脾無明顯病理變化。法氏囊較嚴(yán)重病變出現(xiàn)在感染4周以后，胸腺的嚴(yán)重病變出現(xiàn)在感染6周以后(表1)。對(duì)104TCID50劑量組的病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，法氏囊部分濾泡的淋巴細(xì)胞大量壞死、減少，間質(zhì)結(jié)締組織增生；胸腺出現(xiàn)局部出血，輕度淤血，胸腺小體增多(箭頭所示)；脾內(nèi)脾小結(jié)明顯萎縮，淋巴細(xì)胞減少。法氏囊和胸腺的嚴(yán)重病變分別出現(xiàn)在感染后4周和5周之后。

表1感染REV的SPF雞免疫器官病變打分

Table 1Pathological score of immune organs from the chickens infected with REV

2.3REV感染SPF雞后各免疫器官的病毒載量

1日齡SPF雞感染不同劑量REV后，從第1周開始即可在法氏囊、胸腺和脾內(nèi)檢測(cè)到病毒，不同組織的病毒載量在各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P>0.05)(圖3)。感染后1周，102和104TCID50試驗(yàn)組的組織平均病毒載量分別為106.82copies·g-1和108.54copies·g-1，差異顯著(P<0.05)；從感染后2周至試驗(yàn)結(jié)束，兩感染劑量組的病毒載量差異不顯著(P>0.05)。

2.4REV感染對(duì)NDV和AIV疫苗免疫效果的影響

1日齡SPF雞感染REV后，對(duì)感染雞免疫NDV LaSota弱毒疫苗和AIV H5滅活疫苗，免疫后檢測(cè)HI抗體滴度。從圖4可以看出，NDV弱毒疫苗免疫后1周，兩個(gè)REV感染組的NDV HI抗體滴度就顯著低于未感染組(P<0.05)，隨免疫后時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫抑制作用更為顯著。AIV滅活疫苗免疫后2周，REV感染組的AIV抗體滴度顯著低于未感染組(P<0.05)，兩個(gè)感染組的免疫抑制狀態(tài)一直持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束。104TCID50感染組與102TCID50感染組相比，NDV和AIV抗體滴度降低得更加明顯(P<0.05)。

3討論

REV是禽類除馬立克病病毒、禽白血病病毒之外的第三種重要的致瘤性病毒，同時(shí)也是一種重要的禽免疫抑制性病毒[1]。世界上第一個(gè)REV分離株T株是1958年在英國(guó)分離達(dá)到的[1]。中國(guó)于1986年在南京分離到了第一株REV毒株C45株[9]。隨后，REV在中國(guó)的分布日益廣泛，呈現(xiàn)持續(xù)流行的趨勢(shì)。目前該病已成世界性分布，在各大洲都有流行[1]。研究表明，馬立克病病毒、雞傳染性貧血病毒和REV等免疫抑制性病毒在生產(chǎn)雞群中的混合感染是導(dǎo)致當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)免疫失敗和生產(chǎn)性能下降的重要因素之一[10]。

免疫抑制是指由于各種因素作用，使機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答能力低下甚至喪失的現(xiàn)象[11]。REV本身對(duì)禽的致死力不明顯，但其能夠損害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使機(jī)體的免疫功能下降，從而易遭受其他病原的侵襲。當(dāng)REV與其他病毒發(fā)生混合感染時(shí)，病毒間可相互發(fā)生作用，加重病情[12]。近年來，中國(guó)的雞群為預(yù)防NDV和AIV的發(fā)生采取了非常強(qiáng)化的免疫程序，但是仍有少數(shù)雞群發(fā)病，免疫失敗的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生，這在一定程度上是由于雞群中免疫抑制性病毒的感染造成的。

REV是禽類的一種重要免疫抑制性病毒，目前對(duì)其造成免疫抑制的機(jī)制尚不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)，REV感染1日齡SPF雞可以造成T、B淋巴細(xì)胞數(shù)目的顯著下降[13]。本研究也表明，SPF雞感染REV后兩周開始，法氏囊和胸腺就開始呈現(xiàn)萎縮，脾呈現(xiàn)腫大癥狀，并可見淋巴細(xì)胞壞死減少等組織病理損傷。對(duì)REV-A和雞合胞體病毒形成的嵌合病毒研究表明，REV-A的gag和env兩個(gè)基因片段與其較強(qiáng)的免疫抑制能力有關(guān)[14]。感染REV-T株的雞，其脾細(xì)胞對(duì)促有絲分裂原和植物血凝素的應(yīng)答能力受到抑制，這種抑制與REV-A有關(guān)，而且是由抑制性細(xì)胞群所介導(dǎo)的[15]。

本研究結(jié)果表明，REV早期感染導(dǎo)致NDV弱毒疫苗和AIV滅活疫苗的免疫效果顯著降低；感染雞不僅平均抗體水平較低，而且個(gè)體間差異明顯，個(gè)別雞甚至檢測(cè)不到抗體反應(yīng)；而且這種免疫抑制狀態(tài)可以持續(xù)存在，即使加強(qiáng)免疫也無法消除。對(duì)病毒載量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，REV感染1日齡SPF雞后一周，就可以在其主要免疫器官中檢測(cè)到大量的病毒，并可以持續(xù)存在，這可能是其造成持續(xù)的免疫抑制的原因之一。研究進(jìn)一步表明，100個(gè)TCID50低劑量的REV感染就可以導(dǎo)致上述顯著的免疫抑制，高劑量(104TCID50)REV感染造成的癥狀、病理損傷和免疫抑制現(xiàn)象更為顯著。以上數(shù)據(jù)揭示了當(dāng)前REV在現(xiàn)地的廣泛流行可能是造成多種疫苗免疫失敗的重要因素，從而表明中國(guó)雞群中A類病毒性疾病的預(yù)防不僅需要改進(jìn)這些病的疫苗和加強(qiáng)免疫程序，還需要進(jìn)一步控制雞群中免疫抑制性病毒的感染。同時(shí)，本研究也為進(jìn)一步闡明REV的免疫抑制機(jī)制提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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(編輯白永平)

The Influence of Reticuloendotheliosis Virus Infection on Immune Organs and Immune Efficacy in SPF Chickens

LI Kai，GAO Li，QI Xiao-le，GAO Hong-lei，GAO Yu-long，WANG Yong-qiang，WANG Xiao-mei*

(PoultryImmunosuppressiveDiseaseTeam，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

Key words:reticuloendotheliosis；pathogenicity；immune organs；immunosuppression

Abstract:Reticuloendotheliosis(RE) is an important avian immunosuppressive disease with the mechanism of the immunosuppression barely known.In this study，the influence of a REV strain，HLJR0901 isolated in our lab，infection on the immune organs and immunology competence in SFP chickens was examined.Decline in body weight，atrophy in bursa of Fabricius and thymus，and tumefaction in spleen were detected after REV infection.Histopathology study observed several pathological changes in the main immune organs，including the necrosis and number decline of the immune cells and the hyperplasia of the connective tissues in the bursa of Fabricius，the haemorrhagia and increasing of the thymic corpuscle in the thymus，and atrophy of the splenic follicle in the spleen.High proviral loads were detected in the bursa of Fabricius，thymus and spleen with a long persistence.Additionally，the antibody responses to AIV and NDV vaccines were significantly inhibited by REV early infection compared with the control chickens.This study provided important data for illuminating the mechanism of the REV-induced immunosuppression.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.017

收稿日期：2015-03-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2011DFA32210)；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2013GB23260577)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-42-G3-01)

作者簡(jiǎn)介：李凱(1986-)，男，山東泰安人，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究，E-mail：likai01@caas.cn *通信作者：王笑梅，E-mail：xmw@hvri.ac.cn

中圖分類號(hào)：S852.659.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0340-06