房莉莉

（黑龍江省動物疫病預防與控制中心，黑龍江哈爾濱150069）

病料中細菌分離培養(yǎng)方法和抗生素敏感性試驗

房莉莉

（黑龍江省動物疫病預防與控制中心，黑龍江哈爾濱150069）

1　細菌分離培養(yǎng)的常用方法

細菌分離培養(yǎng)的常用方法有平板劃線分離法、加熱分離法和實驗動物分離法。

1.1平板劃線分離法這是目前臨床上最常用的分離接種方法。它可以從被檢病料中通過劃線分離而獲得單個菌落，以便挑選可疑菌落作純培養(yǎng)加以鑒定。具體操作：右手持接種棒，在酒精燈上火焰滅菌；待接種環(huán)冷卻后，挑取被檢料少許，左手持瓊脂平板，以食指為支點，用拇指和無名指將平皿揭開一空隙。大約20℃時，迅速地將接種環(huán)輕輕地涂布在培養(yǎng)基的邊緣。然后，在涂布處來回移動作曲線形劃線接種。劃線時，以腕力使接種環(huán)在瓊脂平板表面劃動，盡量不要劃破培養(yǎng)基，劃的線條要密，但不能重復舊線，以免培養(yǎng)物形成菌苔。劃線完畢，合上平皿蓋，將瓊脂平板倒置，放入37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2加熱分離法此法適用于污染病料中芽孢桿菌或梭菌的分離。先將被檢病料接種于一管液體培養(yǎng)基，然后將其置于水浴鍋中，加熱到80℃，維持20min，殺死病料中非芽孢菌，而帶有芽孢的細菌仍可存活。再用接種環(huán)取此液于瓊脂平板上劃線分離，視被檢菌的性質(zhì)做需氧或厭氧培養(yǎng)。如估計液體內(nèi)帶有芽孢的細菌數(shù)量少，可先將接種被檢病料的液體培養(yǎng)基作增菌培養(yǎng)后，再在平板上劃線分離。

1.3實驗動物分離法此法適用于污染嚴重的病理材料。如果用常規(guī)的方法，則難以分離到病原菌。具體方法：將被檢病料用生理鹽水或營養(yǎng)肉湯作1：5～10倍稀釋，置于離心機內(nèi)，按1000轉/min的速度離心。取其上清液接種易感實驗動物，而污染的細菌則被機體消滅。待動物死亡后，可立即從其心血或病變組織中分離病原菌。

2　細菌對抗生素敏感性試驗

測定細菌對抗生素敏感性試驗，簡稱藥敏試驗。藥敏試驗對于家禽和特禽細菌性疾病的有效治療起著關鍵性的作用。由于各種病原菌對抗菌藥物的敏感性不同，即使是同種細菌的不同菌株對同一種藥物的敏感性亦有差異。尤其近年來，在獸醫(yī)臨床上廣泛使用抗生素，導致耐藥性菌株不斷出現(xiàn)。如果在臨床上盲目地使用抗生素，往往不能達到預期的效果。因此，在臨床治療前，有條件的飼養(yǎng)場應進行藥敏試驗，以篩選有效的抗菌藥物。

細菌對抗生素的敏感性分為高敏、中敏、低敏和耐藥4種。高敏和中敏是臨床上首選的抗菌藥物，而低敏和耐藥者一般不能應用。測定藥物敏感試驗的方法有多種，但臨床上普遍應用的是紙片擴散法。

2.1藥敏紙片的準備可以使用事先制備的干燥藥敏紙片或市售常用的藥敏紙片，亦可將滅菌的干燥紙片在臨用前浸泡抗菌藥液。

2.2瓊脂培養(yǎng)基的選擇 進行藥敏試驗的瓊脂培養(yǎng)基應選擇適合該菌生長的培養(yǎng)基。其配制方法為：取牛肉300g，去脂肪、腱后絞碎，加蒸餾水1000mL，煮沸1h制成肉浸湯。過濾后，補足水量，再加入酪蛋白酸性水解物17.5g、可溶性淀粉1.5g、瓊脂17g，加溫溶解。調(diào)整pH至7.4，于121℃高壓蒸汽滅菌15min，在90mm直徑的平皿上傾注成4mm厚的瓊脂平板。此外，臨床上也常用普通營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板進行藥敏試驗。對營養(yǎng)要求較高的細菌，如巴氏桿菌、鏈球菌等，應選用血平板培養(yǎng)基。

2.3菌液的準備用接種環(huán)挑取被檢菌純培養(yǎng)菌落4～5個，接種在4～5mL的肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)5～10h。用生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，使其濃度相當于標準濁度管（抑菌圈的大小受菌液濃度的影響較大，因而菌液培養(yǎng)的時間不宜超過17h）。

2.4藥敏試驗操作方法菌液的接種有劃線法和涂布法，即用接種環(huán)蘸取菌液，均勻地劃線或涂抹在瓊脂平板上。待平皿面稍干后，用鑷子夾取各種藥敏紙片，平放在平板上，并輕壓使其貼在平板表面，藥敏紙片7張。兩紙片中心距離不少于24mm，紙片與平皿邊緣不少于15mm。貼好紙片的瓊脂平板在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h后觀察結果。

2.5結果判定根據(jù)藥敏紙片周圍的抑菌圈大小，測定該菌的抗藥程度。因此，必須測量抑菌直徑，按其直徑報告該菌株對某種藥物是高敏、中敏、低敏或耐藥。一般直徑大于 15mm為高敏，10～15mm為中敏，小于10mm為低敏。

2.6影響藥敏試驗的因素藥敏紙片抑菌圈的大小，往往也受一些因素的作用而影響結果的判定。如菌液的濃度、培養(yǎng)基的厚度，都對抑菌圈的大小產(chǎn)生直接的影響。菌液濃度過大、培養(yǎng)基越厚，紙片周圍藥物濃度就越低、抑菌圈也就越小。因此，菌液的濃度應相當于標準濁度管，培養(yǎng)基厚度也不能超過4mm。其次，培養(yǎng)基中的pH對某些藥物抑菌區(qū)影響很大。例如，偏酸時四環(huán)素的抑菌圈變大、紅霉素的抑菌圈變小，故培養(yǎng)基的pH應為7.2～7.4。此外，瓊脂的濃度亦對抑菌圈有影響。瓊脂濃度越大，抑菌圈越小。一般瓊脂的濃度應為1.5%。除上述因素外，平板蓋內(nèi)的水滴落在瓊脂平板上也會影響藥敏試驗的判定結果。因此，放在冰箱中保存的瓊脂平板取出后應放置在37℃溫箱中10min，以除去附在平板蓋內(nèi)的水滴，避免各種不良因素影響藥敏試驗的結果。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.015