楊飛 綜述　　肖東琴　陳竹　馮剛 審校

(1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所·南充市中心醫(yī)院，四川 南充 637000)

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·綜述·

用于構建完整組織工程椎間盤支架材料的研究進展*

楊飛1,2綜述肖東琴2陳竹2馮剛1,2審校

(1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所·南充市中心醫(yī)院，四川 南充 637000)

椎間盤退行性變是臨床上常見的一類高發(fā)病率疾病，是引起下腰痛的主要原因。目前臨床上主要治療手段為保守治療和外科手術治療，但都只能緩解疼痛，難以從根本上解決椎間盤退行病變所造成的結構和功能缺失。隨著組織工程技術的發(fā)展，為模擬天然椎間盤結構和功能而構建的完整組織工程椎間盤為廣大患者帶來新的希望。支架材料作為組織工程椎間盤構建的關鍵環(huán)節(jié)，是目前研究的熱點和難點。本文就構建纖維環(huán)、髓核、軟骨終板和完整組織工程椎間盤4個方面支架材料的研究現狀做一簡要綜述,并提出構建完整組織工程椎間盤支架材料中存在的問題。

椎間盤；組織工程；支架材料

椎間盤退行性變疾病是臨床中一類常見多發(fā)病，是引起下腰痛、脊柱不穩(wěn)、雙下肢失能等臨床癥狀的主要病因。引起椎間盤退行性變的病因和發(fā)病機制至今還不明確，普遍認為年齡、環(huán)境和基因等因素在椎間盤退變過程中起重要作用[1]。目前臨床上傳統的治療手段主要為保守治療和外科手術治療，但均只能緩解臨床癥狀，并不能逆轉已經發(fā)生退行性變的椎間盤組織的結構和功能，且只在椎間盤退行性變的早期有效[2]。在臨床實踐中，椎間盤退行性變患者多處于椎間盤退變的中晚期，需進行完整組織工程椎間盤移植替代[3]。鑒于此，近年來利用組織工程技術構建具有生物學結構和功能的組織來替代發(fā)生退行性變椎間盤的相關研究受到廣泛關注并取得了重要進展。組織工程椎間盤的研究目前主要集中在構建髓核、纖維環(huán)和軟骨終板三方面。髓核位于椎間盤中央，含水量極高，在椎體間起軸承作用，保持各方面應力平衡；纖維環(huán)圍繞髓核呈分層排列，構成椎間盤外圍部分，起著抵抗張力，保持髓核形態(tài)及水分，維持椎間盤強度及脊柱穩(wěn)定性的作用；軟骨終板位于相鄰椎體上下兩面和椎體骺環(huán)內，作為椎間盤與椎體間液體和營養(yǎng)交換的通道，與纖維環(huán)一起將髓核密封起來，具有緩沖、吸收震蕩和保護椎體的作用。因此，模擬天然椎間盤的組織結構和生物學功能，開發(fā)性能良好、促進細胞與組織生長的仿生組織工程支架材料是組織工程椎間盤研究的關鍵環(huán)節(jié)。本文就完整組織工程椎間盤支架材料構建的研究進展進行綜述。

1　纖維環(huán)組織工程支架材料的研究

纖維環(huán)主要成分為Ⅰ型膠原和類軟骨細胞，位于髓核周圍，由薄片狀的纖維板呈同心圓排列而成[4]，分為外纖維環(huán)和內纖維環(huán)，在椎間盤承載扭轉和彎曲負荷中起重要作用[5,6]。當纖維環(huán)被撕裂或刺破時，凝膠狀的髓核將從裂口突出，壓迫相應的神經根和脊髓而產生臨床癥狀。因此，以往大部分的組織工程椎間盤研究主要集中在如何構建有效維護凝膠狀髓核的纖維環(huán)材料方面。

理想的纖維環(huán)支架材料不僅應有良好的機械性能，還要能為纖維環(huán)細胞黏附、生長提供適宜的環(huán)境[7]。目前用于組織工程纖維環(huán)構建的支架材料種類繁多，天然材料如脫礦脫細胞骨基質、蠶絲、藻酸鹽，人工合成材料如聚氨酯、聚乳酸、聚羥基乙酸，及復合材料如聚乳酸/透明質酸 、聚己內酯/殼聚糖等。本文按支架結構特征將其分為兩類：單一構相支架和模擬纖維環(huán)內外環(huán)結構的雙相支架。

1.1單一構相纖維環(huán)支架根據纖維排列方式，單一構相支架又可分為有取向支架和無取向支架。 無取向支架：研究較多的無取向支架生物材料包括去端肽膠原、糖胺聚糖、海藻酸鈉/殼聚糖、聚辛二醇蘋果酸酯等。Sato等運用去端肽膠原構建ACHMS支架，纖維環(huán)細胞在支架上粘附良好，分泌大量I型膠原及蛋白聚糖；將其移植到兔椎間盤內，能有效阻止椎間隙的變窄[8]。ACHMS支架雖具有良好的三維結構和組織相容性，但其力學性能會隨材料的降解急劇降低，且細胞在支架上生長速度較慢，從而限制了該類材料支架的應用。Wan等利用辛二醇與蘋果酸合成的POM支架具有良好抗壓及拉伸強度，與纖維環(huán)細胞復合，移植到小鼠皮下，未發(fā)現明顯的炎癥反應，且產生大量細胞外基質[9]。這類無取向支架能為種子細胞提供良好的生長微環(huán)境和促進細胞外基質表達，但其材料內部纖維排列無取向性，與天然椎間盤纖維環(huán)相比，其力學性能、生物特性等方面還存在較大差異，繼而阻礙了此類支架的發(fā)展。

有取向支架：高度有序的纖維排列結構是椎間盤承受拉伸或剪切應力的結構基礎。因此，環(huán)形纖維薄片中的纖維排列是組織工程纖維環(huán)支架構建中的重要影響因素。研究者們嘗試了運用靜電紡絲纖維、蠶絲, 小腸粘膜下層，以及其他天然纖維材料來模擬自然纖維環(huán)中呈同心圓狀排列的纖維板層[10-17]。Wismer等運用靜電紡絲技術分別構建有方向性和無方向性聚氨酯(PU)靜電紡絲支架，并比較其力學性能、細胞相容性及細胞在支架上基因表達水平等方面的差異[18]。結果表明，有方向性靜電紡絲支架的力學性能與天然纖維環(huán)相近，且能增強細胞粘附、維持細胞表型及促進膠原、蛋白多糖等細胞外基質的沉積，有望成為理想的組織工程纖維環(huán)支架。但其降解速率無法控制、孔隙率較低。Bhattachar等運用蠶絲構建了板層狀纖維支架，與普通多孔蠶絲支架相比，板層狀支架上細胞的糖胺聚糖表達增強，且壓縮和拉伸等力學性能明顯優(yōu)于普通多孔蠶絲支架[13]。在此基礎上，See等在板層狀蠶絲支架上接種骨髓間充質干細胞，并予以軸向壓縮刺激，發(fā)現干細胞在支架上生長良好，且其纖維環(huán)細胞表型相關基因表達顯著增強，據此表明有取向性支架是構建組織工程纖維環(huán)的理想選擇[14]。

1.2雙相纖維環(huán)支架纖維環(huán)的外環(huán)主要由Ⅰ型膠原構成，而內環(huán)富含Ⅱ型膠原。隨著對椎間盤纖維環(huán)認識的深入，纖維環(huán)這種雙相結構特征為研究者們提供了運用不同材料來構建雙相纖維環(huán)的思路。一方面，能克服單相支架材料的不足(如成分單一、機械性能差及生物學功能有限等問題)；另一方面，通過模擬正常纖維環(huán)這種內外環(huán)結構所構建的雙相支架，其生物學性能更加接近正常纖維環(huán)，同時為種子細胞提供與天然纖維環(huán)相似的微環(huán)境。Wan等以骨基質明膠(BMG)為外纖維環(huán)，聚己內酸三醇/蘋果酸酯共聚物(PPCLM)繞成同心圓狀作為內纖維環(huán)，模仿正常纖維環(huán)構建的BMG/PPCLM雙相纖維環(huán)支架[19]。力學性能測試表明，雙相支架具有良好的抗壓縮性能，且拉伸應力是單純PPCLM支架的50倍，其力學性能與兔纖維環(huán)檢測指標相近。將復合兔軟骨細胞的PPCLM/DBM雙相支架移植到裸鼠背部皮下，未見明顯排異反應，且軟骨細胞在支架表面和內部分布均勻，并分泌大量糖胺聚糖、膠原蛋白等細胞外基質。不足之處在于降解速率以及細胞生長微環(huán)境等方面與正常纖維環(huán)相比仍有所欠缺。

聚對苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯(PBST)是一種生物相容性良好、伸縮性強且降解速率低的高分子材料。其降解需在特定的生物酶及適宜溫度條件下發(fā)生，廣泛應用于生物醫(yī)學領域，如可吸收線、創(chuàng)口敷料等[20]。本課題組以BMG為外纖維環(huán)，PBST靜電紡絲薄膜盤繞6～10圈，形成內纖維環(huán)，進而組裝形成同心圓柱纖維環(huán)，復合兔纖維環(huán)細胞，構建新型BMG/PBST雙相組織工程纖維環(huán)[21]。力學性能及生物學實驗表明，PBST力學性能更為優(yōu)良，其壓縮強度(245Mpa)遠大于PPCLM(0.21 Mpa)。BMG/PBST雙相支架不僅具有良好的力學性能和生物相容性，且能較長時間穩(wěn)定維持相關性能。雙相纖維環(huán)模擬纖維環(huán)組織結構和細胞分布特點，不僅在生物特性和力學性能方面更接近正常纖維環(huán)，并且為構建完整組織工程椎間盤奠定了實驗基礎和理論依據。目前針對纖維內環(huán)的研究日趨成熟，但針對纖維外環(huán)的構建仍存在諸多問題，尤其是選擇何種材料，既滿足纖維環(huán)的韌性，又具有合適的剛度，同時兼具良好生物相容性，這有待于醫(yī)學與材料學等學科領域工作者的協力合作。

2　髓核組織工程支架材料的研究

處于椎間盤中心部位的髓核由疏松的纖維軟骨和膠原構成網狀結構，呈膠凍狀。占椎間盤橫斷面積的50%～60%，含有較多水分，起著調節(jié)椎間盤壓力、維持椎間盤彈性和緩沖外力的作用。鑒于髓核在整個椎間盤生理結構和功能方面的特殊作用以及在椎間盤退行性變中的先導地位，構建具有生物學功能的組織工程髓核成為構建完整組織工程椎間盤的中心環(huán)節(jié)。因此，以往椎間盤組織工程的研究中大部分集中于組織工程髓核的構建[22]。為了能真實模擬髓核的組織構成，高分子材料常被用于髓核組織工程的構建。

天然高分子材料具有良好的生物相容性，能為細胞黏附、增殖及表現穩(wěn)定提供良好的微環(huán)境。一方面，研究者們用膠原、藻酸鹽(Alginate)、殼聚糖等制成可注射性凝膠，體外包裹種子細胞，通過注射的方式將生物材料和種子細胞移植到椎間盤髓核部位，減少因移植手術給椎間盤纖維環(huán)帶來的手術創(chuàng)傷[23-25]。這些天然高分子材料形成的支架雖然可以較好地為種子細胞生長和基質蛋白分泌提供條件，但這些材料多為液態(tài)，且它們本身難以維持結構的完整性，在體外很難構建類似生理形狀的組織工程髓核。因此，這類凝膠材料主要用于椎間盤退行性變早期注射治療，而很少用于體外構建具有生理形狀和結構的組織工程髓核；另一方面，為了克服天然材料不能維持自身結構完整性、難以體外塑性等缺點，Chen等在可溶性殼聚糖基礎上，利用1,6己二異氰酸酯(HDI)與小分子量聚乙二醇(PEG)形成的交聯劑與殼聚糖反應，構建新型殼聚糖水凝膠[27]。該水凝膠為半透明狀，具有類似髓核生理狀態(tài)的高親水性，且可根據不同組織形態(tài)塑形。Yuan等進一步研究表明，這種新型水凝膠力學性能、孔隙結構等與正常髓核接近。接種間充質干細胞后移植到兔椎間盤內，細胞增殖良好且細胞外基質蛋白表達正常，能有效阻止退變椎間盤高度變化[28]。這種新型殼聚糖水凝膠具有與髓核相似的結構和功能特征，極有望成為組織工程化髓核的理想選擇。

此外，Gupta等用羥甲基纖維素水凝膠構建CMC髓核支架，并通過比較不同聚合物濃度(1.5, 2.5 and 3.5% w/v)之間的不同，結果顯示：該類材料容易在體外塑型，三種不同聚合物濃度CMC髓核支架都能為骨髓間充質干細胞提供良好的生長環(huán)境，但低聚合物濃度的CMC水凝膠更有利于骨髓干細胞的增殖和分化為髓核樣細胞，并表達相應的細胞外基質[29]。Richardson等采用人工合成多聚左旋乳酸(PLLA)構建髓核支架，結果表明：PLLA髓核支架三維結構與正常髓核相似，可根據不同需要體外塑性，且無明顯細胞毒性，但存在材料親水性差、細胞外基質表達水平低下等問題[30]。人工合成高分子材料相比于天然高分子材料雖然機械性能更好，但它們都難以為種子細胞提供生理狀態(tài)的高親水性環(huán)境，勢必會影響細胞外基質蛋白的合成，進而不利于髓核的修復。

3　軟骨終板

軟骨終板由軟骨細胞和細胞外基質組成，是鄰近椎體的一層透明軟骨。其生物化學成分改變與椎問盤退行性變有密切關系。其中，蛋白多糖分子是控制可溶性物質通過椎間盤的關鍵，軟骨終板的鈣化、硬化、細胞凋亡等都可引起蛋白多糖分子的減少，從而引起葡萄糖、氧和氨基酸等進入椎間盤的滲透性降低，最終導致椎間盤退行性變發(fā)生[31]。隨著對椎間盤退行性變認識的加深，軟骨終板在椎間盤退行性變發(fā)生和發(fā)展中的決定性作用逐漸被揭示，但遺憾的是，以往的組織工程椎間盤研究中，人們將目光主要集中在纖維環(huán)和髓核的構建與修復方面，對軟骨終板的研究報道甚少。

針對軟骨終板組織的特殊生理結構，理想的軟骨終板支架應較薄，同時具有滲透膜特性的三維網絡結構。為了滿足軟骨終板這種特殊結構，目前主要采用靜電紡絲技術方法構建軟骨組織工程支架。較為常見的包括殼聚糖、膠原、羥基磷灰石以及聚乳酸和聚乳酸-羥基乙醇酸共聚物等[32-34]。

Yang等以透明質酸(HA)、硫酸軟骨素(CS)和II 型膠原(Col II)等天然細胞外基質成分為原料，利用靜電紡絲制備仿生軟骨終板組織工程三元復合支架(CCH)[35]。經測試，CCH支架呈高孔隙率的三維建構，具有良好的滲透性和生物相容性，與組織工程纖維環(huán)和髓核復合，有望構建出與正常椎間盤相似的完整組織工程椎間盤。

靜電紡絲技術是目前構建軟骨終板的主要方法，與傳統技術相比，靜電紡絲制備的軟骨終板支架具有以下優(yōu)點：①納米級直徑的電紡纖維可以從形貌上模擬天然細胞外基質膠原纖維[36]；② 靜電紡絲制備的高孔隙率三維支架從微觀上更好的模擬了軟骨終板特有的滲透膜特性，有利于細胞的粘附增殖，且材料孔隙率可調[37]，易加工鑄型[38]。隨著組織工程技術的進步，性能優(yōu)良的組織工程軟骨終板將不斷問世，從而為完整組織工程椎間盤置換成為現實奠定了基礎。鑒于軟骨終板在椎間盤退行性變研究中所起的重要作用，我們期望生物醫(yī)學、材料學等眾多領域的研究工作者能夠投入組織工程軟骨終板的研究中。

4　完整組織工程椎間盤構建

鑒于臨床上椎間盤退行性變患者多數已進入退變晚期，通過纖維環(huán)修復或髓核置換的方法都無法恢復其生物力學功能，最佳治療方法是采用完整組織工程椎間盤，即具有完整髓核、纖維環(huán)和軟骨終板結構的組織工程椎間盤，置換退變的椎間盤[3]。因此，如何構建形態(tài)、力學特性及生物學性能與正常椎間盤相似的完整組織工程椎間盤成為廣大學者研究的熱點。隨著對組織工程纖維環(huán)、髓核及軟骨終板認識與研究的深入，越來越多研究者嘗試構建完整組織工程椎間盤用于修復退變椎間盤，并在動物實驗中取得了一定的成果。

Nesti等以接種了人間充質干細胞的透明質酸水凝膠作為髓核，聚乳酸納米纖維支架為外圍纖維環(huán)，模仿正常椎間盤結構構建組織工程椎間盤[39]。結果表明，間充質干細胞表現出軟骨細胞表型，髓核與纖維環(huán)支架逐漸融合，具有良好的生物相容性。但其力學性能與正常椎間盤相比有較大差異，承受扭轉壓力的能力較差。Mizuno等以聚乙醇酸(PGA)為纖維環(huán)，海藻酸鹽水凝膠為髓核支架材料，分別接種纖維環(huán)細胞和髓核細胞，構建新型組織工程椎間盤[25]。體外實驗發(fā)現細胞在支架材料上增殖良好，且纖維環(huán)與髓核逐漸整合為一體。將其移植到無胸腺鼠皮下，最終移植物形態(tài)與正常椎間盤相似，且細胞外基質成分及機械性能都與天然椎間盤接近。但其在正常椎間盤相應的壓力作用下，是否較長時間保持其相關性能，有待進一步考察。類似研究，Lazebnik等利用聚己酸內酯構建環(huán)形的纖維支架，瓊脂糖水凝膠為髓核支架，并復合豬軟骨細胞，在體外裝配復合椎間盤[40]。發(fā)現軟骨細胞均勻分布在纖維環(huán)與髓核交界處，與單純材料復合支架相比，接種細胞后復合支架的機械性能明顯增強。將其移植到無胸腺鼠的尾椎上，6個月后，組織工程椎間盤仍能維持正常結構，且椎間盤高度、纖維蛋白與蛋白聚糖的表達水平、力學性能等都與正常椎間盤十分接近。雖然以目前的科學技術，將完整組織工程椎間盤用于臨床患者仍面臨許多困難，但以上研究足以證明，至少在小型動物模型中，完整組織工程椎間盤構建與置換是可行的。

5　小結與展望

完整組織工程椎間盤的構建尚處于初步研究階段，為椎間盤退行性變的治療提供了新的思路。隨著組織工程技術的進步，構建結構和功能與天然椎間盤組織相似的組織工程椎間盤將成為可能。但組織工程椎間盤要應用于臨床仍面臨很多挑戰(zhàn)：①在組織工程椎間盤的構建中還存在諸多方案，且各有利弊，其中以支架材料的構建差異最為突出[41]。此外，雖支架種類繁多，尚缺乏真正意義上的仿生學組織工程支架材料。早期的椎間盤組織工程支架材料研究主要集中在大致形態(tài)結構、力學性能、毒副作用等方面，而缺乏對支架孔隙結構、表面特性是否有利于種子細胞黏附、增殖、信號傳遞及細胞外基質穩(wěn)定表達的研究，即構建真正意義上的仿生支架。②以往關于軟骨的報道不少，但關于組織工程椎間盤軟骨終板的研究仍較匱乏，軟骨終板在椎間盤退行性變中的作用機制及組織工程軟骨終板的構建將是未來需要攻克的難題。③既往的研究大部分都局限于髓核或纖維環(huán)組織工程的構建，但是單獨的部位移植具有明顯的局限性。因為臨床患者大多已經處于椎間盤退行性變晚期，而此時需要植入的是具有完整生物學功能的仿生學組織工程椎間盤。因此，如何構建完整的仿生學組織工程椎間盤將是未來研究的重點。此外，纖維環(huán)、髓核和軟骨終板在體外組裝后，如何使其融合成為完整的有機體，這也是未來研究的難點。但隨著支架材料構建，種子細胞獲取以及細胞培養(yǎng)、基因修飾與體內移植技術的日趨進步，完整組織工程椎間盤置換極有希望成為現實。

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Research development of scaffold materials for fabricating complete tissue engineered intervertebral disc

YANG Fei1reviewingXIAO Dongqin2, CHEN Zhu2, FENG Gang1,2checking

(1.SouthwestUniversityofMedicalSciences,Luzhou646000，Sichuan,China;2.InstituteofTissueEngineeringandStemCells,NanchongCentralHospitalandTheSecondClinicalInstituteofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Intervertebral disc degeneration is a common high-risk disease in clinic, which is the main cause of low back pain. At present, conservative treatment and surgical treatment as the main treatments for intervertebral disc degeneration can only alleviate the pain and hardly fundamentally solve the structural and functional loss triggered by degenerative intervertebral disc. With the development of tissue engineering technology, the whole tissue engineering intervertebral disc fabricated by simulating the structure and function of natural intervertebral disc brings new hope to patients. As a key link in the construction of tissue engineered intervertebral disc, scaffold material is a research focus and difficult. In this paper, a brief review was elaborated from annulus fibrosus, nucleus pulposus, cartilage end-plate and complete intervertebraldisc, respectively. The problem in the construction intervertebral disc scaffold was also put forward in this essay.

Intervertebral disc; Tissue engineering; Scaffold Materials

國家自然科學基金(81171472、81201407)；四川省教育廳創(chuàng)新團隊資助項目(13TD0030)；四川教育廳重大培育項目(15CZ0021)

馮剛，教授，本刊副主編，E-mail:Pgenecloner@163.com

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.038

2016-04-22; 編輯： 張文秀)