范 玲 吳東方 劉殿雷?

急性結腸炎大鼠胃腸動力改變與ICC破壞有關研究

范 玲 吳東方 劉殿雷?

目的 在大鼠結腸炎模型基礎上，初步探討炎性腸病大鼠胃腸動力障礙的可能機制。方法 將40只SD大鼠隨機分成對照組和急性結腸炎組。腸炎組采用乙酸灌腸法制備，造模第3天，兩組均禁食24 h，次日經(jīng)口灌入印度墨汁，麻醉后剖腹取出賁門至直腸末端快速測量墨汁在胃腸道的推進長度及胃腸道全長的長度，計算胃腸傳輸速率；用透射電鏡觀察遠端結腸Cajal間質細胞（ICC）的超微結構變化；采用Weston Blot方法檢測ICC膜上c-kit蛋白表達。結果 與對照組比較，腸炎組胃腸傳輸速度明顯減慢（P＜0.05）；電鏡下，對照組遠段結腸肌層超微結構為ICC呈紡錘形，有巨大的卵圓形核及向外伸展的長突起，胞質內(nèi)有豐富的線粒體、大量的內(nèi)質網(wǎng)，ICC與腸神經(jīng)元及平滑肌細胞之間緊密聯(lián)系；而腸炎組遠端結腸肌層中ICC體積增大，胞質內(nèi)線粒體腫脹、部分線粒體空泡樣變，溶酶體數(shù)目增多，出現(xiàn)次級溶酶體內(nèi)質網(wǎng)擴張，ICC與神經(jīng)細胞及平滑肌間連接松散；Westernblot分析結果顯示，與對照組比較，腸炎組遠端結腸ICC c-kit蛋白質的表達量顯著降低（P＜0.05）。結論 炎性腸病可導致胃腸動力障礙，其機制與ICC的破壞有關。

結腸炎 Cajal間質細胞 c-kit 電子顯微鏡 大鼠

據(jù)報道，自1950年至1980年，一直將炎性腸病歸為是西方國家的疾病。在北美和歐洲，其發(fā)病率處于較高水平［1］。但近年來，隨著環(huán)境及飲食結構的改變，我國炎性腸病發(fā)病率逐年上升［2］，其中兒童炎性腸病的發(fā)病率明顯升高，已嚴重影響患者生活質量，同時消耗了大量的醫(yī)療衛(wèi)生資源。據(jù)有關研究發(fā)現(xiàn)，炎性腸病常有一個急性炎癥反應的病理過程，其臨床癥狀常伴隨胃腸動力障礙，但炎性腸病所引起的胃腸動力障礙機制尚不明確。本實驗旨在通過觀察急性結腸炎大鼠胃腸傳輸速率及Cajal間質細胞（ICC）的變化，為進一步闡明急性結腸炎胃腸功能障礙的病理機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料 2個月月齡健康Sprague-Dawley大鼠40只，平均體重（200±20）g，雌雄隨機，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)；兔抗大鼠c-kit多克隆抗體購自Santa Cruz公司。兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法 （1）急性結腸炎模型的建立與分組：40只2個月月齡健康Sprague-Dawley大鼠，隨機分成空白對照組（對照組）（20只）和急性結腸炎組（腸炎組）（20只）。大鼠禁食24h后，用2%戊巴比妥鈉（50mg/ kg，ip）經(jīng)腹腔注射麻醉后，將聚乙烯導管經(jīng)肛插入大鼠結腸內(nèi)，插入深度約6～8cm，腸炎組注入50ml/L乙酸溶液0.5ml，對照組大鼠注入等量生理鹽水，采用尾高頭低位作用20s后用生理鹽水沖洗3次。造模后第2天，腸炎組動物出現(xiàn)腹瀉，大便稀糊。（2）胃腸傳輸速率的測定：兩組大鼠于造模第3天禁食24h后，經(jīng)口灌入印度墨汁0.5ml，于30min后用2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉。將兩組已麻醉的大鼠再隨機分為兩小組，每小組各10只。將其中一小組腸炎組和對照組大鼠開胸經(jīng)左心室升主動脈用生理鹽水快速沖洗血液，用10%甲醛（含1%氯化鈣）灌注固定后，剖腹取出胃腸道從賁門至直腸末段；將另外一小組腸炎組和對照組大鼠脫頸處死，剖腹取出同前胃腸道，快速測出墨汁在胃腸道的推進距離及胃腸道全長，計算墨汁推進長度占胃腸道全長的百分比，即胃腸傳輸速率［3］。（3）組織標本的制備：胃腸道傳輸速率測定完畢后，于距離回盲部約3～4cm處取長約5cm的相同部位結腸，已灌注固定的結腸組織經(jīng)后固定、脫水、透明，包埋及切片備用于HE染色；未經(jīng)灌注固定的新鮮結腸組織分成兩部分，取其中小部分結腸組織，每塊組織切成lmm3大小快速放入2.5%戊二醛固定液中于4℃固定保存?zhèn)渥鲭婄R觀察，其余部分組織放入-86℃超低溫冰箱保存。（4）HE染色：已備切片經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精水化，蘇木素著色，鹽酸分化，氨水反藍，伊紅染色，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察并拍照。（5）電鏡標本制備：已固定的結腸組織，經(jīng)0.01 M PBS漂洗，1%鋨酸后固定1h，0.01 M PBS再漂洗，酒精及丙酮梯度脫水，丙酮與包埋劑混合逐步包埋成塊，用半超薄切片機及超薄切片機切片后，經(jīng)3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后在透射電子顯微鏡下觀察，并拍照。（6）Western blot法檢測c-kit的表達：取新鮮大鼠結腸組織，并用常規(guī)方法提取總蛋白，BCA方法定量蛋白濃度。每個標本上樣約100μg蛋白于12%SDS-PAGE 凝膠，電壓80V約30min，改電壓為125V約持續(xù)1h。然后從凝膠中采用半干轉膜法轉移蛋白質至PVDF膜，用含5%無脂牛奶TBST封閉，滴加兔抗大鼠c-kit多克隆抗體4℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG抗體孵育1h，用 ECL顯色，X線膠片曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及結腸組織病理學表現(xiàn) 對照組大鼠大便正常，活動性好，皮毛光滑，生長良好；腸炎組大鼠均于造模第2天出現(xiàn)腹瀉，無進攻性，明顯懶動，皮毛毛糙。實驗后動物第3天結腸組織病理學表現(xiàn)：對照組結腸黏膜上皮結構完整，腺體排列整齊，少量炎性細胞浸潤（見圖1）；腸炎組大鼠結腸可見黏膜及黏膜下層水腫充血，大量急性炎性細胞浸潤，可見黏膜潰瘍（見圖2）。

圖1 正常對照組結腸組織HE（×400）

圖2 炎癥組結腸組織HE（×400）

圖3 對照組大鼠遠端結腸電鏡結構：上方平滑肌細胞（SMC），內(nèi)見線粒體、密斑（白色↙所示）及排列整齊的肌絲，細胞間連接緊致；中間ICC內(nèi)可見大的長橢圓形細胞核及大量線粒體（黑色粗→所示），下方肌間神經(jīng)元（N），內(nèi)見神經(jīng)分泌顆粒（○所示）及線粒體，細胞間聯(lián)系緊密

圖4 腸炎組大鼠遠端結腸電鏡結構：上方ICC，內(nèi)可見擴張的內(nèi)質網(wǎng)（↖所示）、腫脹的線粒體（↗所示）及次級溶酶體（黑色○所示）；中間是神經(jīng)元（N）；下方SMC，內(nèi)可見腫脹的線粒體（白色○所示），細胞間聯(lián)系不清

2.2 胃腸傳輸速率的測定 腸炎組胃腸平均傳輸速率為（48.2±5.2）%，對照組大鼠為（60.3±3.0）%，腸炎組大鼠胃腸傳輸速率較對照組明顯延遲（P＜0.05）。

2.3 透射電子顯微鏡觀察結果 大鼠遠段結腸肌內(nèi)及肌間ICC超微結構：（1）對照組大鼠結腸肌內(nèi)及肌間ICC向外伸出長的突起，形狀如紡錘形。細胞內(nèi)可見巨大橢圓形或卵圓形核；胞漿豐富，內(nèi)含大量粗、滑面內(nèi)質網(wǎng)及線粒體，可見質膜穴樣凹陷以及發(fā)達的高爾基體；腸神經(jīng)元、ICC及平滑肌細胞之間可見連接緊致（見圖3）。（2）腸炎組大鼠結腸肌內(nèi)及肌間ICC電子密度降低，體積偏大，內(nèi)可見嵴排列紊亂、斷裂或消失，形態(tài)變圓腫脹的線粒體，部分線粒體見空泡樣改變；溶酶體偏多，可見次級溶酶體；內(nèi)質網(wǎng)擴張，可見空泡形成，質膜穴樣凹陷結構不清，與周圍神經(jīng)元及平滑肌連接松散。與對照組比較，腸炎組中ICC少見，細胞結構難以辨清（見圖4）。（3）Western blot法檢測結果：用Western blot法檢測大鼠遠端結腸肌內(nèi)c-kit 蛋白質表達量，以GAPDH作為內(nèi)參照。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳及PVDF膜蛋白質印記后結果可顯示一條分子量為145 KD蛋白質條帶，與c-kit分子量大小相符，內(nèi)參照蛋白條帶GAPDH出現(xiàn)于36 KD。通過比對GAPDH與c-kit相對灰度值，而計算出c-kit蛋白表達倍數(shù)改變情況（Fold change），結果顯示腸炎組大鼠遠端結腸c-kit蛋白表達水平與對照組比較，其表達明顯下降（P＜0.05）。

3 討論

隨著逐年攀升的胃腸道炎癥性疾病發(fā)病率，胃腸道炎癥引起的運動障礙機制已成為關注焦點，當前許多學者認為胃腸動力障礙與胃腸道的腸神經(jīng)系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸激素、ICC及自身免疫等因素密切相關。本實驗主要以SD大鼠遠端結腸為觀察對象，通過建立大鼠結腸炎模型，觀察其遠端結腸組織內(nèi)ICC改變與胃腸運動的關系初步探討胃腸運動障礙的機理。

胃腸道廣泛分布著ICC，其在維持胃腸道正常的生理功能中發(fā)揮重要作用，是胃腸道慢波起搏細胞?，F(xiàn)已有研究表明多種胃腸動力疾病的發(fā)生與ICC變化密切有關，ICC超微結構、細胞數(shù)目及其生理功能改變可能是導致許多胃腸動力障礙疾病的病理生理學基礎［4-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)ICC位于神經(jīng)終末和平滑肌細胞之間［6-7］，并發(fā)現(xiàn)ICC與腸神經(jīng)及比鄰肌細胞之間形成特殊的“神經(jīng)-ICC-平滑肌”功能單位［8］。Ramany認為ICC是自主神經(jīng)纖維與平滑肌傳遞信號的中間介導體，自主神經(jīng)可通過ICC對慢波電位活動的影響而建立胃腸平滑肌的收縮節(jié)律［9-10］。部分研究表明，腸道炎癥反應可導致周圍神經(jīng)組織及平滑肌細胞結構損傷，ICC超微結構改變、數(shù)目減少，其與平滑肌細胞失去正常聯(lián)系，功能上表現(xiàn)為ICC電活動異常及神經(jīng)傳遞障礙導致腸道異常蠕動［11-12］。本實驗通過電鏡研究觀察到：對照組大鼠遠段結腸肌內(nèi)及肌間ICC呈紡錘形，胞漿內(nèi)含豐富粗、滑面內(nèi)質網(wǎng)、線粒體及發(fā)達的高爾基體和質膜穴樣凹陷，細胞向外伸出長突起；ICC與平滑肌細胞及腸神經(jīng)元之間緊密聯(lián)系。炎癥組ICC體積偏大，線粒體嵴斷裂或消失，腫脹甚至空泡樣變；溶酶體數(shù)目偏多，可見次級溶酶體；內(nèi)質網(wǎng)擴張，胞質內(nèi)有空泡形成，質膜穴樣凹陷結構不清；ICC與平滑肌細胞及神經(jīng)細胞間連接松散。比較而言，腸炎組中ICC較對照組中數(shù)目減少，細胞結構不清，難以辨認，典型的“神經(jīng)-ICC-平滑肌”功能單位破壞。這些超微結構的改變提示其可能導致胃腸運動障礙。

c-kit蛋白屬跨膜蛋白，是細胞膜上一種酪氨酸激酶蛋白，其受體表達于所有ICC。主要通過c-kit受體ICC接受胞外多種刺激信號。多項研究發(fā)現(xiàn)c-kit與干細胞因子（stem cell factor，SCF）構成SCF/c-kit信號系統(tǒng)，當編碼kit和或SCF的基因發(fā)生突變，SCF/c-kit信號途徑受損，會導致胃腸道部分ICC亞群增殖、分化和發(fā)育障礙［13-15］，臨床常表現(xiàn)為反流性食道炎、胃潴留、十二指腸內(nèi)容物逆流等胃腸功能障礙癥狀。本實驗采用western blot 法檢測急性結腸炎模型SD大鼠遠端結腸c-kit蛋白表達情況，結果顯示為相較于正常對照組腸炎組c-kit蛋白的表達量明顯下降，結合電鏡觀察結果顯示ICC數(shù)目減少，提示c-kit蛋白表達下降可能影響ICC細胞的分化、發(fā)育，甚至增殖，從而導致胃腸動力障礙。

本實驗通過對大鼠結腸急性炎癥的研究，表明炎性腸病可導致胃腸動力障礙即胃腸傳輸速率下降，其機制與ICC的破壞有關，具體機制尚需進一步基礎研究。

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Objective To preliminarily study the possible mechanism of disorder intestina1 motility of acute colitis based on the model of SD rats with acute colitis. Methods 40 rats were randomly divided into control group and acute colitis group．The model of acute colitis rats was built by clyster with acetic acid. Three days later，both groups of rats were were fasted for 24 hours，and the next day 0.5 mL India ink were poured into orally. 30 min later，the rats were anesthetized，then we cut into the abdomen to get the whole digestive tube from cardia to the terminal rectum and quickly measured the ink promoting length in the gastrointestinal tract and the length of the whole gastrointestinal tract to calculate their ratio to get the rate of gastrointestinal transit. Electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of interstitial cells of Cajal （ICC） . Western blot analysis was used to detect the expression of c-kit protein on the membranes of ICC. Results Compared to rats in control group，the rate of gastrointestinal transit in rats with acute colitis signifcantly decreased（P＜0.05）. Under electron microscope，ultrastructure of interstitial cells of Cajal in muscle of distal colon of control rats was like the spindle，containing a huge oval nucleus and long processes stretching out，and the cytoplasm is rich in mitochondria，a large number of endoplasmic reticulum. Cell links was close among ICC，intestinal neurons and smooth muscle cells. While in acute colitis group，the volume of ICC in the distal colon muscle layer increased，swollen mitochondria in the cytoplasm，some mitochondria vacuolar degeneration，increased numbers of lysosomes and endoplasmic reticulum expansion in secondary lysosomes. The loose cell link among ICC，intestinal neurons and smooth muscle cells was observed. Western blot analysis revealed thatbut c-kit protein expression in ICC in distal colon tissues in acute colitis group was signifcantly reduced compared to control group（P＜0.05）.Conclusions Infammatory bowel disease can lead to gastrointestinal motility disorder. The mechanism involved is related to the destruction of ICC.

Acute colitis Interstitial cells of Cajal C-kit Electron microscopy Rats

浙江省中醫(yī)藥管理局優(yōu)秀青年基金項目（2013ZQ026）；杭州市科技發(fā)展計劃項目（20140733Q34）

310007 杭州鋼鐵集體公司職工醫(yī)院兒科（范玲）

325000 溫州醫(yī)學院組胚教研室（吳東方）

310007 杭州市中醫(yī)院外一科（劉殿雷）

*通信作者