鄒競慧 李笛悠 張 萍?

PAK5和P-gp與上皮性卵巢癌相關(guān)性的臨床研究

鄒競慧 李笛悠 張 萍?

目的 研究PAK5和P-gp與EOC臨床因素的相關(guān)性，為預(yù)測上皮性卵巢癌（EOC）進(jìn)展及患者預(yù)后提供指導(dǎo)。方法 回顧分析自2013年1月至2015年6月接受手術(shù)治療且經(jīng)病理確診為EOC的患者，回顧整理患者的病理類型、FIGO分期、細(xì)胞分化和化療耐藥等臨床資料，并用免疫組織化學(xué)方法測定EOC中PAK5和P-gp的表達(dá)量，分析PAK5和P-gp在EOC組織中的表達(dá)情況及與臨床資料的關(guān)系。結(jié)果 在EOC患者組織中，單因素分析，PAK5的陽性率在FIGO分期晚期組高于FIGO早期組，細(xì)胞低分化組高于中高分化組（P均＜0.01）。PAK5與病理類型陽性率無明顯差異（P＞0.05）。P-gp的陽性率在FIGO分期晚期組高于FIGO早期組，細(xì)胞低分化組高于中高分化組（P均＜0.01）。PAK5與病理類型陽性率無明顯差異（P＞0.05）。PAK5陽性率在耐藥組高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。P-gp陽性率在耐藥組高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)論 PAK5和P-gp在EOC組織中均呈高表達(dá)，PAK5和P-gp陽性表達(dá)量與FIGO分期、細(xì)胞分化不良和化療耐藥有關(guān)，對預(yù)測上皮性卵巢癌疾病發(fā)展及患者預(yù)后有重要意義。

上皮性卵巢癌（EOC） PAK5，P-gp 免疫組織化學(xué) 病理類型 化療耐藥

卵巢癌是婦科疾病中僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的常見腫瘤，惡性程度高，病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首。其中卵巢上皮性惡性腫瘤（EOC）約占卵巢原發(fā)性惡性腫瘤的85%～90%。其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，約70%～80%的EOC患者在初診時(shí)已經(jīng)處于晚期，病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首［1］。PAK5主要在成熟的神經(jīng)組織中表達(dá)［2］，在正常的胃腸組織、胰腺、卵巢和睪丸等組織也有表達(dá)［3］。最近研究表明PAK5在一些腫瘤組織中過表達(dá)，并且隨著惡性程度增高，表達(dá)含量增高［4］。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)方法測定PAK5和P-gp在原發(fā)性上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)情況，分析PAK5、P-gp的表達(dá)與卵巢癌的耐藥、患者的生存及預(yù)后的相關(guān)性，以此評價(jià)這些分子靶標(biāo)用于預(yù)后判斷的可能性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 自2013年1月至2015年6月在本院婦科接受手術(shù)治療和術(shù)后化療，且有明確病理學(xué)診斷的原發(fā)性上皮性卵巢癌患者52例，年齡23～70歲，平均55歲。病理類型：漿液性癌27例，粘液性癌12例，透明細(xì)胞癌9例，子宮內(nèi)膜樣癌4例。FIGO分期（2009年標(biāo)準(zhǔn)）：I～I(xiàn)I期18例，Ⅲ～Ⅳ期34例。分化程度中高分化19例，低分化33例。所有患者均接受卵巢癌根治術(shù)或卵巢腫瘤減滅術(shù)；術(shù)后均接受正規(guī)的化療治療；術(shù)前均未接受任何形式的放療與化療；排除其他部位惡性腫瘤及非原發(fā)性、非上皮性卵巢癌；無嚴(yán)重的內(nèi)科功能性或器質(zhì)性病變；隨訪資料完整。

1.2 用藥方法 靜脈滴注3h/d，紫杉醇135～175mg/ m2，卡鉑按曲線下面積（AUC）510～715（AUC=5），d1，或順鉑（DDP）70～100mg·（m2/d），3周為1個(gè)周期，F(xiàn)IGO早期化療4～6周期，F(xiàn)IGO晚期化療6～8周期。為預(yù)防藥物反應(yīng)，采取以下措施：（1）給藥前12h及6h口服地塞米松20mg。（2）化療前30min給予靜脈推注西米替丁及肌肉注射異丙嗪。（3）化療過程中進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)、充分液體水化，及藥物保護(hù)肝臟、抗嘔吐等治療。

1.3 復(fù)發(fā)評價(jià) （1）腫瘤標(biāo)記物升高。（2）影像學(xué)（B超、CT、MRI、PET-CT等）出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移征象。（3）體格檢查發(fā)現(xiàn)腫塊。（4）出現(xiàn)胸腹水。（5）不明原因腸梗阻。（6）其他（如不明原因的發(fā)熱等）。

1.4 化療藥物敏感性評價(jià) 腫瘤對化療藥物的不敏感表現(xiàn)包括以下三種情況，研究中［12］將腫瘤耐藥型、持續(xù)狀態(tài)型、頑固型歸為TP耐藥組，一線方案化療完成6個(gè)月后腫瘤復(fù)發(fā)稱為化療藥物敏感型復(fù)發(fā)，本研究將未復(fù)發(fā)及藥物敏感型復(fù)發(fā)歸為TP敏感組。（1）腫瘤耐藥：指以紫杉醇和鉑類為基礎(chǔ)的化療完成后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的腫瘤進(jìn)展。（2）腫瘤持續(xù)狀態(tài)：指計(jì)劃的一線方案化療完成后，仍然有臨床可測量的病灶以及穩(wěn)定病灶。（3）腫瘤頑固型：指鉑類藥物化療中，腫瘤仍在進(jìn)展的情況。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 （1）主要試劑：小鼠單克隆抗體Anti-PAK5抗體，Anti-P-gp抗體，SP免疫組化試劑購自美國Abcom公司產(chǎn)品，EDTA修復(fù)液，PBS溶液（0.01M）購于谷歌生物，DAB顯色劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，BSA（牛血清白蛋白）購于北京索萊寶科技有限公司。（2）實(shí)驗(yàn)步驟：烘烤，脫蠟和水化，洗滌，抗原修復(fù)，洗滌，消除過氧化物酶，洗滌，封閉，加一抗，復(fù)溫，洗滌，加二抗，洗滌，孵育，顯色，復(fù)染，分化，返藍(lán)，脫水，透明，封片等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAK5和P-gp陽性表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理因素 見表1。

2.2 PAK5和P-gp蛋白在卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感組織中的表達(dá) 耐藥組PAK5蛋白陽性表達(dá)率59.0%（13/22）明顯高于敏感組陽性表達(dá)率20%（6/30），差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。耐藥組P-gp蛋白陽性表達(dá)率68.1%（15/22）明顯高于敏感組陽性表達(dá)率0%（0/30），差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 PAK5染色與陽性表達(dá)情況 見圖1。

表1 52例卵巢癌患者的臨床病例特征與PAK5，P-gp蛋白的表達(dá)（n）

圖1 卵巢癌組織中PAK5的表達(dá)（SP，×100）（AB為化療敏感組，CD為化療耐藥組）

2.4 P-gp染色與陽性表達(dá)情況 見圖2。

圖2 卵巢癌組織中P-gp的表達(dá)（SP，×200）（AB為化療敏感組，CD為化療耐藥組）

3 討論

EOC來源于卵巢表面的生發(fā)上皮，占卵巢癌的90%。根據(jù)病理組織學(xué)形態(tài)的不同，上皮性卵巢癌主要可分為漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌以及混合性癌與未分類癌，其中漿液性癌占上皮性卵巢癌40%～55%。根據(jù)核分裂相計(jì)數(shù)和核異型程度，漿液性癌又可分為高級別與低級別性癌，研究表明，不同類型的上皮性卵巢癌的組織學(xué)結(jié)果和生物學(xué)行為存在較大差異［5］。臨床回顧性單因素分析，均在某種程度上證明患者的發(fā)病年齡、病理類型、FIGO分期、細(xì)胞分化程度等因素中的一種或多種對疾病進(jìn)展及患者預(yù)后有影響［6］。本研究證明PAK5和P-gp在FIGO中晚期的陽性率明顯高于FIGO早期，因此，PAK5和P-gp陽性表達(dá)與FIGO分期晚期有關(guān)，對預(yù)測上皮性卵巢癌分期及疾病進(jìn)展有指導(dǎo)意義。根據(jù)細(xì)胞生長異型性的程度，細(xì)胞可分為高、中、低分化，細(xì)胞分化代表了腫瘤細(xì)胞的惡性程度，分化不良的腫瘤體生長較迅速，而且侵襲力強(qiáng)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的重要因素。PAK5和P-gp在低分化組的陽性率明顯高于高中分化組。因此，測定PAK5和P-gp表達(dá)強(qiáng)弱與分布，可以幫助評估疾病的惡性程度。在病理類型為粘液性卵巢癌、子宮內(nèi)膜樣癌及透明細(xì)胞性癌的比較中PAK5和P-gp陽性率差異均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但漿液性癌的PAK5和P-gp陽性率略高于其他病理類型類型，有待納入更多患者的進(jìn)一步分析。目前認(rèn)為P-gp主要分布在有分泌功能的上皮細(xì)胞胞膜中，當(dāng)化療藥物進(jìn)入細(xì)胞后，P-gp識別并與之結(jié)合，隨后引起ATP結(jié)合區(qū)活化，從而水解ATP產(chǎn)生能量，導(dǎo)致跨膜通道的構(gòu)象發(fā)生改變，主動(dòng)將抗腫瘤藥物泵出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，隨后再次發(fā)生ATP分子水解，P-gp恢復(fù)至原來的構(gòu)象，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。目前有研究發(fā)現(xiàn)P-gp的表達(dá)水平和活性狀態(tài)與細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中Erk1/2的激活有關(guān)［7］，此外，向藥物敏感的卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MDR1基因使其表達(dá)增高，可以導(dǎo)致Erk1/2信號通路的持續(xù)激活，但是對MAPK家族中另外兩個(gè)信號通路JNK和p38的激活無明顯影響。說明除作為藥物泵發(fā)揮作用，P-gp還通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)參與調(diào)節(jié)耐藥細(xì)胞的其他生物學(xué)行為。隨后進(jìn)一步機(jī)理方面的研究發(fā)現(xiàn)P-gp的這種作用可能通過與其他蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，如多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)P-gp能夠與CD44、Anxa2及caveolin等存在相互作用，目前已知這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程均發(fā)揮重要作用［8］。

本資料結(jié)果表明，PAK5在EOC中過表達(dá)，且隨著卵巢癌惡性程度增加，PAK5表達(dá)量增高。PAK5與卵巢癌化療耐藥有關(guān)，下調(diào)PAK5表達(dá)增強(qiáng)卵巢癌對紫杉醇的敏感性。提示PAK5可能是卵巢癌紫杉醇耐藥的核心調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，該蛋白可能參與紫杉醇對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和耐藥性的獲得。作者推測PAK5基因可能通過某種途徑作用于細(xì)胞骨架中的肌球蛋白和微管結(jié)合，影響細(xì)胞膜的功能，改變了細(xì)胞的抗藥性［9-10］。通過探索PAK5誘發(fā)EOC細(xì)胞耐藥的具體機(jī)制，為干預(yù)有效的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)或研發(fā)新型腫瘤藥物提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證了PAK5和P-gp在EOC中高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)PAK5的表達(dá)與FIGO晚期（Ⅲ+Ⅳ期）、組織分化不良及化療耐藥密切相關(guān)，PAK5和P-gp與這些臨床因素的關(guān)系為預(yù)測患者疾病進(jìn)展、預(yù)后以及化療效果提供指導(dǎo)，在臨床檢測中可以加強(qiáng)對PAK5和P-gp的定性、定量檢測，藥物調(diào)節(jié)PAK5和P-gp的表達(dá)及信號傳導(dǎo)通路將可能成為抗上皮性卵巢癌耐藥治療的嶄新靶點(diǎn)。

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Objective To investigate the clinical factors correlation of PAK5 and P-gp in EOC，in order to provide guidance to predict disease progress and prognosis of EOC patients. Methods Research objects were the patients who accepted surgery in Department of Gynecology and were diagnosed epithelial ovarian cancer defnitely by pathological diagnosis in our hospital from January 2013 to June 2015. We carried out a retrospective study of the clinical factors，such as，pathological type，F(xiàn)IGO stages，cell differentiation，chemoresisitance and so on. Immunohistochemistry（IHC）staining was performed to investigate the expression of PAK5 and P-gp. Finally，we analyzed the expression of PAK5 and P-gp in EOC tissue and the correlation of PAK5 and P-gp and the above clinical factors. Results 1.The positive rate of PAK5 in FIGO advanced group was higher than in FIGO early group，the positive rate of PAK5 in poor cell differentiation group was higher than in well and moderate cell differentiation group（81.8%vs 47.3%），differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.01）. However，there was not signifcant difference in positive expression rate of PAK5 when grouped by pathological type（P＞0.05）.The positive rate of P-gp in FIGO advanced group was higher than in FIGO early group，the positive rate of P-gp in poor cell differentiation group was higher than in well and moderate cell differentiation group，differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.01）. However，there was not signifcant difference in positive expression rate of P-gp when grouped by pathological type（P＞0.05）.2.The positive rate of PAK5 in chemoresistance group was higher than in chemosensitivity group，differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.05）. The positive rate of P-gp in chemoresistance group was higher than in chemosensitivity group，differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.001）. Conclusion PAK5 and P-gp were high-expressed in epithelial ovarian cancer. The positive expression of PAK5 and P-gp were related to the FIGO late stages，poor cell differentiation，chemoresistance.PAK5 and P-gp could be used to predict the disease progression and prognosis of patients in epithelial ovarian cancer.

EOC PAK5 P-gp Immunohistochemistry（IHC） Pathological type FIGO stages Chemoresistance

200092 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦科

*通信作者