呂心路 王金湖?

CD123與CD47在急性髓細胞白血病干細胞中的表達及臨床意義

呂心路 王金湖?

目的 探討CD123與CD47在急性髓細胞白血病（AML）干細胞中的表達，及其與臨床預(yù)后的關(guān)系。方法 納入2009年3月至2015年8月急性髓細胞白血病患者127例（AML組），并納入23例健康體檢者作為對照組。采用流式細胞儀檢測骨髓干細胞內(nèi)的CD123與CD47表達，觀察不同患者兩種標(biāo)記物的表達，并分析兩種標(biāo)記物陽性表達與患者療效和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 CD47在各種亞型患者干細胞中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CD47高表達患者90例，常規(guī)治療后完全緩解率（CR）低，白血病發(fā)病率高。CD123在不同類型的患者中表達程度存在一定差異，AML組CD123陽性表達率為63.0%，遠高于健康對照17.4%，其陽性表達患者臨床預(yù)后較差。結(jié)論 CD123與CD47可作為判斷急性白血病預(yù)后的診斷指標(biāo)。

急性髓細胞白血病 CD123 CD47 流式細胞儀

急性髓細胞白血?。ˋML）是一種涉及染色體移位與基因突變的髓系造血干胞惡性疾病［1］。研究表明，白血病干細胞是AML發(fā)生、發(fā)展的原始細胞，在抵御化療藥物方面發(fā)揮重要作用［2-3］。近來，CD123、CD44、CD96等AML干細胞內(nèi)過表達的分子陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［4-5］。但少有研究對CD47與CD123的表達進行報道，并分析其表達與臨床預(yù)后的關(guān)系［6-8］。本文應(yīng)用多參數(shù)流式細胞儀分析AML患者中兩種抗原的表達，并就其表達與臨床預(yù)后的關(guān)系進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2009年3月至2015年8月入住本院接受治療的AML患者127例，其中男77例，女50例；年齡23～78歲，中位年齡47歲?；颊卟∏榘碏AB標(biāo)準(zhǔn)分類如下：M0期3例、M1期14例、M2期32例、M3期27例、M4期25例、M5期15例、M6期11例。同時，納入同期接受體檢的健康對照23例，其中男17例，女6例；年齡24～56歲，中位年齡34周歲。所有患者均簽署知情同意。

1.2 流式細胞分析 采集患者骨髓2～5ml（EDTA抗凝），按常規(guī)方法分離單個核細胞。將骨髓樣本（50μl）加入熒光標(biāo)記抗體（20μl）。加入磷酸鹽緩沖液制備單細胞懸液，細胞濃度為1×106/ml。采用多色熒光流式細胞技術(shù)（FITC、PE、PERCP、APC）進行流式細胞檢查。正常對照與患者設(shè)CD38細胞陰性門測定CD34+CD47+、CD34+CD123+表達。采用DIVA軟件分析200，000個細胞，獲得CD47與CD123表達百分比，根據(jù)CD45/SSC設(shè)門檢測白細胞免疫表型，設(shè)門后檢測白血病細胞幼稚細胞，結(jié)果判斷以白血病細胞表面抗原表達超過陰性對照20%為抗原表達陽性。

1.3 治療方案與療效評判 AML患者誘導(dǎo)化療方案如下：M2期誘導(dǎo)治療方案為VDCP+Ara-c，M3期為口服維甲酸聯(lián)合靜脈三氧化二砷，M4與M5期患者采用HAD或DA方案，M6期采用CAG方案。療效評判依據(jù)1987年蘇州全國白血病化療會議標(biāo)準(zhǔn)進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法與Log-rank法對患者生存率進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者CD47與CD123的表達 大多數(shù)AML患者均檢測到CD47與CD123表達（見圖1）。健康對照中CD47陽性表達僅2例，陽性表達率為8.7%，而患者組CD47陽性表達患者有90例，陽性表達率為70.9%，兩組的CD47表達有明顯差異（P＜0.01）。根據(jù)FAB分型，3例M0中2例陽性，14例M1中10例陽性，32例M2中25例陽性，27例M3中20例陽性，25例M4中20例陽性，15例M0中10例陽性，11例M0中9例陽性。各亞型中CD47表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；颊呓MCD123陽性表達率為63.0%，遠高于健康對照17.4%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CD123在不同類型的患者中表達程度存在一定差異（見表1）。

表1 AML亞型白血病干細胞內(nèi)CD47與CD123表達差異［n（%）］

圖1 流式細胞圖

2.2 CD47、CD123表達與AML預(yù)后的關(guān)系 127例患者中失訪患者數(shù)8例（排除放棄治療或轉(zhuǎn)院治療的患者），其余均入組隨訪14～28個月。根據(jù)CD47和/或CD123表達陽性或陰性進行分組，其中CD47陽性患者90例，復(fù)發(fā)49例，CD123陽性患者78例，復(fù)發(fā)40例，雙陽性患者56例，復(fù)發(fā)39例。隨訪14個月期間，2例CD47、CD123患者死亡，占1.57%。14個月后CD47陽性患者死亡6例，占6.67%，CD123陽性患者死亡10例，占12.8%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。生存分析表明，CD47陽性患者生存期低于CD47陰性患者，同樣，CD123陽性患者低于CD123陰性患者，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。表明CD47與CD123過表達是AML預(yù)后差、生存期短的風(fēng)險因素。

2.3 CD47、CD123表達與化療后緩解的關(guān)系 在90例CD47陽性患者中，30例行化療2個療程后獲得明顯緩解（CR），而陰性表達患者中，緩解率達74.1%，兩者差異顯著。CD123表達陽性患者中化療2個療程后緩解率明顯低于陰性表達患者。

圖2 CD47與CD123患者生存期比較

3 討論

白血病干細胞為能產(chǎn)生異質(zhì)性白血病細胞的特定細胞群，在白血病細胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等方面發(fā)揮重要作用［9］。白血病干細胞對常規(guī)化療藥物不敏感，是白血病治療中耐藥和緩解后復(fù)發(fā)的根源。目前已有研究對白血病干細胞內(nèi)的抗原表達進行了報道，作者對CD47與CD123表達進行報道，并探討其表達與療效和預(yù)后間的關(guān)系。

CD47為一種廣泛表達于細胞膜表面的免疫球蛋白，在結(jié)構(gòu)上，其為特定的整聯(lián)蛋白、G蛋白及膽固醇組成［10］。研究稱，正常造血干細胞表面CD47的表達有助于維持機體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，而AML患者白血病干細胞表面的CD47過表達可抵御機體吞噬細胞的吞噬，以降低免疫系統(tǒng)對該類細胞的清除作用［11］。此外，AML、膀胱癌等多種腫瘤患者體內(nèi)腫瘤干細胞內(nèi)均存在CD47過表達，且CD47高表達與臨床預(yù)后相關(guān)［12］。Uno等［13］研究表明，CD47可能與小鼠AML發(fā)病、預(yù)后不良相關(guān)。本資料中，CD47陰性表達AML患者化療后緩解率明顯高于陽性表達患者，與既往研究相符。另外，M2與M3幾個亞型的陽性率較其他分型相對較低，而其預(yù)后優(yōu)于其他亞型。所以，CD47陽性率可能提示不良預(yù)后。推測其原因，作者認(rèn)為可能與CD47對機體吞噬細胞的抑制作用相關(guān)，即吞噬細胞不能有效識別CD47陽性表達的白血病干細胞，最終導(dǎo)致其化療敏感性降低。

CD123為白血病干細胞資深相對特異的表面抗原，在多數(shù)AML患者原始白血病細胞中表達。研究表明，將CD123+細胞亞群植入非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠后，可誘發(fā)AML發(fā)?。?4］。Jordan等用流式細胞儀對原代AML細胞的研究顯示，88.9%的標(biāo)本中CD34+/CD38-細胞高度表達CD123，而正常骨髓來源的CD34+/CD38-細胞幾乎不表達CD123抗原［15］。因此作者認(rèn)為CD123有可能成為選擇性清除AML細胞的治療策略。有研究通過構(gòu)建靶向急性髓性白血病干細胞的溶瘤腺病毒Ad.sp-E1A-sCAR-IL-3來抑制CD123表達，進而達到改善白血病干細胞對化療的敏感性，結(jié)果表明，該方法能夠達到抑制白血病干細胞增殖，并誘導(dǎo)其白血病干細胞凋亡［16］。臨床上，劉曄華等［6］報道，CD123分子在不同類型的急性白血病患者體內(nèi)表達存在差異，且其陽性表達與原發(fā)耐藥性或復(fù)發(fā)相關(guān)。本資料中，陽性表達率遠高于健康對照，且CD123表達陽性患者化療2個療程后緩解率明顯低于陰性表達患者。證實CD123表達可以作為評價AML預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，并可用于提示化療后緩解與復(fù)發(fā)的情況。

綜上所述，AML患者表面CD47、CD123存在過表達，可能誘發(fā)化療敏感性降低，原發(fā)細胞耐藥性增強、易復(fù)發(fā)及生存期縮短等。本研究為以CD47、CD123為靶向的治療AML的方案提供了依據(jù)，并初步評估CD47與CD123作為預(yù)測患者預(yù)后指標(biāo)的可能性。

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Objective To investigate the expression of CD123 and CD47 in the leukemia stem cells in patients with acute myelocytic leukemia（AML），as well as the correlation between their expression of clinical prognosis. Methods One hundred and twenty-seven AML patients admitted to our hospital from March 2009 to August 2015 were included in this study. Besides，twenty-three healthy individuals received physical examination in our hospital served as control. CD123 and CD47 expression was determined using fow cytometry. In addition，the correlation between their expression and the clinical prognosis was evaluated. Results No difference was noticed in the expression of CD47 in the subtypes of AML patients. CD47 expression was noticed in 90 patients，which showed poor clinical outcome after chemotherapy. Whereas，for the patients with positive expression of CD123，statistical difference was observed in the patients with various subtypes. Higher positive rate of CD123 was observed in AML patients compared to the normal control. Conclusions CD123 and CD47 could be used as predictors for the prognosis of AML patients.

Acute myelocytic leukemia CD123 CD47 Flow cytometry

215400 蘇州大學(xué)附屬太倉醫(yī)院

*通信作者