況夏雨 綜述，李州利 審校

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原　030001)

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·綜述·

BCG灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞因子與膀胱纖維化的研究進(jìn)展

況夏雨 綜述，李州利 審校

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原030001)

膀胱纖維化是以過量細(xì)胞外基質(zhì)在膀胱間質(zhì)、肌層聚集進(jìn)而導(dǎo)致膀胱收縮、舒張功能減退、破壞甚至喪失為特征的病理過程。膀胱內(nèi)灌注BCG在治療膀胱癌的過程中，產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過協(xié)同或拮抗作用，通過促進(jìn)膀胱細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖活化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌、影響膀胱組織的血管生成等方式影響膀胱纖維化的進(jìn)程。本文綜述了近年來有關(guān)膀胱內(nèi)灌注BCG產(chǎn)生的細(xì)胞因子與膀胱纖維化發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展。

BCG;纖維化;細(xì)胞因子;成纖維細(xì)胞;血管生成

卡介苗(bacillus calmette-guerin，BCG)是牛型結(jié)核桿菌在特殊的人工培養(yǎng)基上，經(jīng)數(shù)年的傳代，喪失對人類的致病能力，但仍保持有足夠高的免疫原性的疫苗。1970年BCG首次被應(yīng)用為抗腫瘤治療。在動物實(shí)驗(yàn)中，BCG被證實(shí)對非肌層浸潤性膀胱癌有效，是治療膀胱癌最有效的免疫療法。BCG灌注治療的副反應(yīng)較為常見：全身副作用包括發(fā)熱、全身不適、肝功能異常甚至其他器官的結(jié)核感染；局部副作用包括尿頻、尿急、尿痛、血尿，嚴(yán)重者造成膀胱攣縮[1-2]。

膀胱內(nèi)灌注BCG可引起膀胱纖維化，并非為少見并發(fā)癥，因纖維化很容易被修復(fù)，很少造成嚴(yán)重后果而被忽略。膀胱內(nèi)間斷性、低劑量灌注BCG即人工誘導(dǎo)膀胱炎反復(fù)發(fā)作，其結(jié)果是膀胱組織炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層及肌層細(xì)胞外基質(zhì)沉積，膠原纖維增生，引起膀胱纖維化。黎瑋等[3]的研究表明，10例患者行膀胱內(nèi)灌注6周后，黏膜下層的纖維化均可被觀察到。若纖維化持續(xù)進(jìn)展，膀胱體積會明顯縮小甚至攣縮，膀胱順應(yīng)性降低，繼發(fā)膀胱反流、輸尿管擴(kuò)張甚至腎積水。BCG灌注引起膀胱攣縮的發(fā)病率僅占0.5%～2%[4]，但其發(fā)病的危險(xiǎn)程度隨灌注次數(shù)及劑量的增加而增加，與結(jié)核桿菌導(dǎo)致的纖維化及攣縮高發(fā)病率相比[5]，BCG引起的膀胱纖維化弱而短暫，造成的攣縮率低，這可歸結(jié)為BCG的毒性低、感染易控制、引起的變態(tài)反應(yīng)弱、感染持續(xù)時(shí)間短等。研究表明，BCG不引起組織的破壞性反應(yīng)，因而可除外因組織損傷修復(fù)引起的纖維化病理反應(yīng)[6]。據(jù)此我們推測BCG及結(jié)核桿菌引起的膀胱纖維化至少有一部分是因?yàn)槠渌せ畹拿庖呒?xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子所致。本文重點(diǎn)闡明膀胱灌注BCG產(chǎn)生的細(xì)胞因子引起膀胱纖維化的可能機(jī)制。

1　BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子

膀胱內(nèi)灌注BCG時(shí)，會發(fā)生一系列的免疫反應(yīng)，可分為如下三個階段：第一階段，黏附，即BCG通過Ag85與膀胱上皮細(xì)胞表面的纖維連接蛋白相互作用而黏附于細(xì)胞上；第二階段抗原提呈階段， BCG被抗原提呈細(xì)胞和膀胱上皮細(xì)胞識別并提呈給CD4+T細(xì)胞；第三階段：誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)，如CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞大量增值并分泌大量的細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素1β(interlerleukin-1 beta，IL-1β)、包括白細(xì)胞介素2(interlerleukin-2， IL-2)、白細(xì)胞介素3(IL-3)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、白細(xì)胞介素17(IL-17)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、血小板源性生成因子(platelet derived growth factor，PDGF)、成纖維細(xì)胞生成因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、干擾素(interferon，INF)、結(jié)締組織生成因子(connective tissue growth factor, CTGF)等[7-9]。細(xì)胞因子除了來源于免疫細(xì)胞，也常來源于膀胱逼尿肌細(xì)胞及黏膜層細(xì)胞。MARCIA[9]的研究表明， BCG灌注時(shí)膀胱黏膜可被誘導(dǎo)表達(dá)40種基因與細(xì)胞因子，而膀胱逼尿肌則被誘導(dǎo)產(chǎn)生高達(dá)92基因與細(xì)胞因子，這些誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因、細(xì)胞因子與膀胱內(nèi)灌注LPS、TNF-α相比具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

上述免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用。在這些細(xì)胞因子中，輔助型TH1細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12)是抑制腫瘤細(xì)胞分裂和生長最重要的細(xì)胞因子，其中 IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖活化并促進(jìn)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子；IL-12可促進(jìn)TH0和CTL的增殖，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子；IFN-γ可提高人體HLA抗原的表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，并通過抑制血管生成等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞生成。其他細(xì)胞因子如IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17等也在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。這些細(xì)胞因子在殺傷、限制膀胱腫瘤細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用。然而細(xì)胞因子對機(jī)體的影響是多方面的，這些細(xì)胞因子在一定濃度、活性范圍內(nèi)時(shí)具備積極的生理功能，一旦失去平衡將會不可避免的對周圍的組織、細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生作用，促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖活化，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而引起膀胱纖維化及攣縮。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，有的可單獨(dú)引起纖維化，有的可協(xié)同或拮抗其他細(xì)胞因子起作用。

2　細(xì)胞因子與膀胱纖維化

2.1TGF-βTGF-β即轉(zhuǎn)化生長因子-β，其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在炎癥和纖維化過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已證實(shí)TGF-β在很多膀胱疾病如糖尿病性膀胱疾病、膀胱出口梗阻、間質(zhì)性膀胱炎及泌尿系腫瘤中起著重要作用[10]。

膀胱內(nèi)灌注BCG時(shí)TGF-β的表達(dá)增加與膀胱纖維化關(guān)系密切。學(xué)者認(rèn)為TGF-β主要來源于活化的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，其影響膀胱纖維化的作用主要表在如下方面。

首先，TGF-β可介導(dǎo)膀胱上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。間質(zhì)細(xì)胞根據(jù)其在膀胱中的位置可分為固有層間質(zhì)細(xì)胞、肌層間質(zhì)細(xì)胞、肌束間間質(zhì)細(xì)胞及血管周圍間質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞與膀胱功能密切相關(guān)并具有向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，在病理情況下，可引起膀胱纖維化[11]。TGF-β通過Smad2/3/4復(fù)合體將信號傳遞至細(xì)胞核，改變細(xì)胞基因的表達(dá)，通過減少膀胱上皮細(xì)胞表面分子標(biāo)志如上皮-鈣黏素(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白5(cytokeratin5)、細(xì)胞角蛋白14(cytokeratin14)，增加間質(zhì)細(xì)胞表面分子標(biāo)志如神經(jīng)-鈣粘素(N-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)，促使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并增加膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[12]。

第二，TGF-β可促進(jìn)促纖維化因子CTGF、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)[13-14]。CTGF具備很多生物學(xué)功能包括誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌及細(xì)胞的遷移和分化等，正常情況下很少表達(dá)，但在纖維化病變中表達(dá)急劇升高并能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中MMP-2、MMP-9的產(chǎn)生。MMP-2、MMP-9具備降解基膜的功能，隨著基膜的降解，細(xì)胞外基質(zhì)可發(fā)生遷移，在與CTGF/CCN2協(xié)同作用下，進(jìn)一步促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，加快膀胱纖維化的進(jìn)程[15]。

第三,TFG-β可以改變膀胱膠原纖維的表達(dá)。膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膀胱壁的膠原纖維主要為Ⅰ和Ⅲ型膠原纖維，其中，Ⅲ型膠原纖維的含量是膀胱順應(yīng)性的決定性因素，其含量增加將會導(dǎo)致膀胱壁彈性喪失和平滑肌功能減退。TFG-β通過Smad3途徑傳遞信號，增加Ⅰ和Ⅲ型膠原纖維的含量，促進(jìn)膀胱纖維化[16]。除此之外，相關(guān)研究表明AP-1和miR-133在調(diào)控TGF-β的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中起重要作用[17-18]。

2.2bFGFbFGF即堿性成纖維細(xì)胞生長因子，被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、甚至某些上皮細(xì)胞有效的促分裂原，在膀胱生成、發(fā)育以及對損傷反應(yīng)中有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，低氧、缺血、各種損傷、炎癥等可迅速提高bFGF基因的表達(dá)。研究表明bFGF參與很多膀胱纖維化疾病的進(jìn)展，如膀胱出口梗阻、慢性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱等。膀胱內(nèi)灌注BCG時(shí)，膀胱黏膜下層及肌層大量淋巴細(xì)胞浸潤，并形成肉芽腫[19]，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)迅速促進(jìn)bFGF的合成并從巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中釋放出來，促進(jìn)周圍成纖維細(xì)胞的增殖，增加平滑肌細(xì)胞間膠原纖維的沉積[20]。此外FGF-2/FGFR信號通路還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降低上皮細(xì)胞表面標(biāo)志如E-cadherin等功能[ 20-21]。

2.3TNF-αTNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。膀胱內(nèi)灌注BCG時(shí)，TNF-α能增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能，對許多免疫細(xì)胞有趨化和粘附作用，在防止感染擴(kuò)散及殺滅腫瘤細(xì)胞起到很重要的作用。然而，過度的TNF-α表達(dá)在促纖維化中的作用也不容忽視，其參與膀胱內(nèi)灌注BCG引起膀胱纖維化的可能機(jī)制如下：①誘導(dǎo)膀胱成纖維細(xì)胞的增值、分化，促進(jìn)膠原的合成。Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維是膀胱纖維組織中最重要的膠原成分。TNF-α可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞合成I型、Ⅲ型前膠原纖維[22]。②TNF-α可促進(jìn)BCG灌注時(shí)膀胱的炎癥反應(yīng)。TNF-α對巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞有較強(qiáng)的趨化作用，可促進(jìn)免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)，繼而增加成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膀胱纖維化。

2.4細(xì)胞因子與血管生成血管生成是一個涉及多種細(xì)胞、多種分子的復(fù)雜過程,是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用結(jié)果，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破，血管生成將發(fā)生紊亂，導(dǎo)致器官的功能紊亂及纖維化。

抑制腫瘤血管生成是BCG灌注治療膀胱癌一個很重要的途徑[23]。研究表明，BCG灌注誘導(dǎo)的過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子對膀胱血管生成的影響是多方面的，如INF-γ、TNF-α、IP-10有明顯的抗血管生成作用，而VEGF和bFGF具有明顯促進(jìn)血管生成的作用，但這些細(xì)胞因子的綜合作用是抑制膀胱血管生成[24]。在諸多具備血管活性的細(xì)胞因子中，VEGF是最重要的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子，在BCG治療膀胱癌的過程表達(dá)明顯上調(diào)，但相關(guān)研究表明，細(xì)胞因子的總體作用是抑制血管生成，提示其他細(xì)胞因子如INF-γ、TNF-α、IP-10等在拮抗VEGF的過程中發(fā)揮重要作用[25]。在這些細(xì)胞因子的綜合作用下，膀胱血管生成紊亂，導(dǎo)致膀胱局部缺血、缺氧，間質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積而致纖維化。而最新研究發(fā)現(xiàn)，通過納米技術(shù)持續(xù)向膀胱內(nèi)釋放VEGF促進(jìn)膀胱血管生成，能夠明顯延緩甚至逆轉(zhuǎn)膀胱纖維化及膀胱攣縮的病程[26]，提示組織缺血缺氧是膀胱纖維化一個很重要的因素。

3　小結(jié)與展望

BCG所致的膀胱纖維化涉及多個細(xì)胞因子，是一個非常復(fù)雜的過程。事實(shí)上，上述研究存在很多局限性，細(xì)胞因子構(gòu)成的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及各種細(xì)胞因子的相互作用、相互影響遠(yuǎn)非想象中的簡單；并且隨著灌注時(shí)間的推移，細(xì)胞因子的種類及數(shù)量也會發(fā)生變化，因而還有許多促纖維化機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。BCG感染是研究結(jié)核的經(jīng)典模型，可作為膀胱結(jié)核研究的切入點(diǎn)，為臨床上預(yù)防及治療結(jié)核性膀胱纖維化及攣縮提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｉ鲜龅臋C(jī)制可部分解釋膀胱纖維化的原因，相信通過對BCG致纖維化的機(jī)制進(jìn)一步研究，將為結(jié)核性膀胱纖維化及攣縮尋找有效的治療靶點(diǎn)提供新的途徑。

[1] PééREZ-JACOISTE ASN MA, FERNNDEZ-RUIZ M. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) infection following intravesical BCG administration as adjunctive therapy for bladder cancer: incidence, risk factors， and outcome in a single-institution series and review of the literature [J]. Medicine (Baltimore),2014,93(17):236-254.

[2] ASTRAM A, KHADIJAH A, YURI P, et al. Effective dose and adverse effects of maintenance Bacillus Calmette-Gue’Rin in intermediate and high risk non-muscle invasive bladder cancer: a meta-analysis of randomized clinical trial[J]. Acta Med Indones,2014,46(4):298-307.

[3] 黎瑋,蔡文清,劉貴生，等.卡介苗膀胱灌注前后膀胱組織超微結(jié)構(gòu)的觀察[J].中華泌尿外科雜志，1997,18(5)：282-285.

[4] VETORAZZO FILHO JE, BAHIA LA, VEDOVATO BC, et al. Cystectomy with orthotopic ileal neobladder reconstruction for treatment of bladder contracture after intravesical bacillus Calmette-Guerin therapy [J]. Einstein (Sao Paulo)， 2014,12(4):502-504.

[5] 黃海超,李昕,金杰.239例腎結(jié)核的發(fā)病情況及臨床癥狀[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013,45(4):600-604.

[6] SHKURUPIY VA, KIM LB, POTAPOVA OV, et al. Fibrogenesis in granulomas and lung interstitium in tuberculous inflammation in mice [J]. Bull Exp Biol Med，2014，156(6):731-735.

[7] 鄧婉鑫,黃衛(wèi)人,邵志會,等.BCG治療非肌層浸潤性尿路上皮癌研究進(jìn)展[J]. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015,25(3):187-188.

[8] AHIRWAR DK, MANCHANDA PK, MITTAL RD, et al. BCG response prediction with cytokine gene variants and bladder cancer: where we are? [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2011,137(12):1729-1738.

[9] SABAN MR, O’DONNELL MA, HURST RE, et al. Molecular networks discriminating mouse bladder responses to intravesical bacillus Calmette-Guerin (BCG), LPS, and TNF-alpha [J]. BMC Immunol， 2008,9:4.

[10] HEISE RL, PAREKH A, JOYCE EM, et al. Strain history and TGF-β1 induce urinary bladder wall smooth muscle remodeling and elastogenesis [J]. Biomech Model Mechanobiol,2012，11(1-2):131-145.

[11] 尹焯,楊金瑞.膀胱間質(zhì)細(xì)胞與膀胱病理生理[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,39(6):644-618.

[12] ISLAM SS, MOKHTARI RB, EL HOUT Y, et al. TGF-β1 induces EMT reprogramming of porcine bladder urothelial cells into collagen producing fibroblasts-like cells in a Smad2/Smad3 dependent manner [J]. J Cell Commun Signal,2014,8(1):39-58.

[13] KASAI H, ALLEN JT, MASON RM, et al. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT) [J]. Respir Res, 2005,6:56.

[14] ZAVADIL J, B?TTINGER EP. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions [J]. Oncogene,2005,24(37):5764-5774.

[15] CHARRIER A, BRIGSTOCK DR. Regulation of pancreatic function by connective tissue growth factor (CTGF, CCN2) [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2013,24(1):59-68.

[16] 鄭小青,鄭浩,呂夷松,等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1通過Smad-3對膀胱慢性炎癥纖維化的調(diào)節(jié)作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014,31(9):1968-1970.

[17] DUAN LJ, QI J, KONG XJ, et al. MiR-133 modulates TGF-β1-induced bladder smooth muscle cell hypertrophic and fibrotic response: implication for a role of microRNA in bladder wall remodeling caused by bladder outlet obstruction [J]. Cell Signal,2015,27(2):215-227.

[18] RAMACHANDRAN A, GANGOPADHYAY SS, KRISHNAN R, et al. JunB mediates basal- and TGFβ1-induced smooth muscle cell contractility [J]. PLoS One，2013,8(1):e53430.[19] 盧根生,金錫御,宋波,等.BCG膀胱灌注對局部免疫細(xì)胞功能的影響[J].中華泌尿外科雜志，1996,17(4):210-212.

[20] LODILLINSKY C, LANGLE Y, GUIONET A, et al. Bacillus Calmette Guerin induces fibroblast activation both directly and through macrophages in a mouse bladder cancer model [J]. PLoS One，2010,5(10):e13571.

[22] 袁瑞紅.EGF、bFGF、PDGF、TNF-α及NGF對瘢痕成纖維細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].昆明:昆明醫(yī)科大學(xué)，2004:36-39.

[23] REIS LO, FERREIRA U, BILLIS A, et al. Anti-angiogenic effects of the superantigen staphylococcal enterotoxin B and bacillus Calmette-Guérin immunotherapy for nonmuscle invasive bladder cancer [J]. J Urol，2012,187(2):438-45.

[24] PAVLOVICH CP, KRLING BM, STEWART RJ, et al. BCG-induced urinary cytokines inhibit microvascular endothelial cell proliferation [J]. J Urol，2000,163(6):2014-2021.

[25] KERIGH BF, BAHRAMI A, SHAMSA A, et al. Assessment of angiogenic factor, vascular endothelial growth factor, serum and urine level changes in superficial bladder tumor immunotherapy by intravesical Bacillus Calmette-Guerin [J]. Urol Ann，2010,2(3):91-95.

[26] XIONG Q, LIN H, HUA X, et al. A nanomedicine approach to effectively inhibit contracture during bladder acellular matrix allograft-induced bladder regeneration by sustained delivery of vascular endothelial growth factor [J]. Tissue Eng Part A，2015,21(1-2):45-52.

(編輯王瑋)

2016-02-17

2016-03-09

李州利，主任醫(yī)師. E-mail：lizhouli@medmail.com

況夏雨(1992-)，男(漢族)，碩士研究生.研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail：kxy0502@163.com

R737.14

ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.10.020