劉相飛　高　靜　陳玉東

(勝利油田中心醫(yī)院心內(nèi)科，山東　東營(yíng)　257034)

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血小板衍化生長(zhǎng)因子-D基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的相關(guān)性

劉相飛高靜陳玉東

(勝利油田中心醫(yī)院心內(nèi)科，山東東營(yíng)257034)

摘要〔〕目的探討血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)-D rs7950273位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)的相關(guān)性。方法237例冠心病(CHD)患者根據(jù)冠脈造影及血管內(nèi)超聲檢查(IVUS)結(jié)果將粥樣斑塊分為穩(wěn)定斑塊組(65例)、易損斑塊組(89例)、混合斑塊組(83例),采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)PDGF-D rs7950273基因多態(tài)性及測(cè)序鑒定，并選擇112例正常者為對(duì)照。結(jié)果CHD組(62 例,26.2%)CC基因型頻率顯著高于對(duì)照組(16 例,14.2%),而對(duì)照組GG基因(39例,34.8%)高于CHD組(43例,18.1%)。CHD組C等位基因頻率(256例,54.1%)明顯高于對(duì)照組(89 例,39.7%)。CHD亞組間基因頻率分布特點(diǎn)為穩(wěn)定斑塊組與易損斑塊組、混合斑塊組差異顯著(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)DGF-D rs7950273位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)的相關(guān),C 等位基因使易損斑塊的發(fā)生率增加。

關(guān)鍵詞〔〕冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊;基因多態(tài)性;血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)-D rs7950273

第一作者：劉相飛(1981-)，男，碩士，主要從事冠心病、心律失常介入治療研究。

血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)是體內(nèi)一種較強(qiáng)的促細(xì)胞增長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，其分子量約為28～35 kD的陽(yáng)離子糖蛋白，可由血小板、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，與機(jī)體組織的新陳代謝、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。冠心病(CHD)發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，而冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊破裂和血栓成為導(dǎo)致主要心血管事件的病理基礎(chǔ)，而如何提前預(yù)測(cè)斑塊的性質(zhì)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。近年來(lái),PDGF-D在AS發(fā)生和斑塊穩(wěn)定性中的作用日益引起醫(yī)學(xué)界的高度重視〔1〕。本研究將從分子生物學(xué)水平闡述PDGF-D rs7950273位點(diǎn)基因多態(tài)性是否與粥樣斑塊血管內(nèi)超聲(IVUS)顯像特征相關(guān)。

1資料與方法

1.1一般資料2010年6月至2014年5月我院心內(nèi)科住院并行冠脈造影+IVUS檢查的237例患者。依據(jù)冠脈造影+IVUS結(jié)果分組：①穩(wěn)定斑塊組：65例，男43例，女22例，平均年齡(62.1±9.3)歲；②易損斑塊組：89例，男58例，女31例，平均年齡(62.9±10.3)歲；③混合斑塊組：83例，男57例，女26例，平均年齡(61.5±9.4)歲；另選取體檢健康者為對(duì)照組：112例，男75例，女37例，平均年齡(61.9±9.6)歲。四組年齡、性別、吸煙比例、高血壓比例、糖尿病比例、甘油三酯及膽固醇均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。根據(jù)病史及輔助檢查排除各種感染性疾病、腫瘤、結(jié)核、肝腎疾病、結(jié)締組織病、甲狀腺疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病等。

表1　各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)指標(biāo)±s)

1.2方法①基因組DNA的提取。均于入院后抽取3 ml靜脈血，應(yīng)用乙二胺四乙酸抗凝管，分離白細(xì)胞，應(yīng)用低滲溶血法提取基因組DNA。②引物設(shè)計(jì)與合成。采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由中國(guó)奧科生物公司合成。PDGF-D rs7950273位點(diǎn)上游引物5'-GCCACATTTAGCCATTCT-3'；下游引物5'-TGTTGGGATGAAGAAAGG-3'。③基因型檢測(cè)。首先采用PCR方法擴(kuò)增包含PDGF-D基因rs7950273位點(diǎn)的目的基因DNA片段。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶(BsmAⅠ)進(jìn)行酶切，隨后應(yīng)用 3.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，最后應(yīng)用凝膠成像儀拍照后確定基因型。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物隨機(jī)抽取，委托深圳華大基因公司采用Sanger法進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1PDGF-D rs7950273基因型檢測(cè)結(jié)果rs7950273位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)3種基因型：CC基因型(320 bp 1條帶)，GG基因型(192、128 bp 2條帶)，雜合子CG基因型(320、192、128 bp 3條帶)，見(jiàn)圖1?；驕y(cè)序結(jié)果與酶切結(jié)果完全一致。見(jiàn)圖2。

2.2基因多態(tài)性分布特點(diǎn) PDGF-D rs7950273位點(diǎn)的等位基因頻率在CHD各亞組和對(duì)照組的分布特點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)。CHD組CC基因型頻率顯著高于對(duì)照組,而對(duì)照組GG基因高于CHD組。CHD組C 等位基因高于對(duì)照組(P<0.05)。穩(wěn)定斑塊組與易損斑塊組、混合斑塊組差異顯著(P<0.05)，易損斑塊組與混合斑塊組差異不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表2。

1、3為CC基因型；2、5為GG型；4、6為CG型；M.Marker圖1　酶切后3.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2　基因型測(cè)序圖

組別n等位基因頻率CG基因型頻率CCCGGGCHD組237256(54.1)1)218(45.9)1)62(26.2)1)132(55.7)1)43(18.1)1)穩(wěn)定斑塊組6556(43.1)2)74(56.9)2)9(13.8)2)38(58.5)2)19(27.7)2)易損斑塊組89102(57.4)76(42.6)28(31.5)46(51.7)15(16.9)混合斑塊組8395(57.2)71(42.8)26(31.3)43(51.8)14(16.9)對(duì)照組11289(39.7)135(60.3)16(14.2)57(50.9)39(34.8)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與易損斑塊組、混合斑塊組比較：2)P<0.05

3討論

PDGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員之一，包括5中形式：PDGF-A、-B、-AB、-C、-D，其中D鏈基因位于11q22染色體上。CHD是由多個(gè)基因及環(huán)境因素相互作用所致的常見(jiàn)復(fù)雜性疾病。“常見(jiàn)疾病、多個(gè)易感基因、微效作用”理論提出個(gè)體的易感基因遺傳變異可能顯著增加CHD發(fā)病率。遺傳度大于20%的表型具有明顯的遺傳傾向，流行病學(xué)研究也證實(shí)CHD患者多數(shù)存在家族聚集性〔2〕。近年來(lái)，CHD遺傳學(xué)方面研究致力于尋找AS的遺傳致病/易感基因，確定這些致病/易感基因是否有利于確定干預(yù)靶點(diǎn)和早期危險(xiǎn)識(shí)別。

在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，各種原因所致?lián)p傷的內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及激活的單核巨噬細(xì)胞都能以自分泌和旁分泌釋放PDGF，并在斑塊表面過(guò)度表達(dá)，而PDGF作為一種平滑肌細(xì)胞的趨化因子，除促進(jìn)平滑肌細(xì)胞在AS發(fā)展過(guò)程中不斷積聚外，還可與相應(yīng)的受體結(jié)合促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集和細(xì)胞外基質(zhì)沉積〔3～5〕。AS斑塊可分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊，后者又稱(chēng)為易損斑塊。研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的易損斑塊包括多種病理類(lèi)型，其中最常見(jiàn)的病理性類(lèi)型為富含炎癥的薄帽的纖維粥樣斑塊(TCFA)〔6〕，其主要特征包括大的脂質(zhì)核(占斑塊面積的25%)、薄的纖維帽(<65 μm)，斑塊內(nèi)富含巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、基質(zhì)成分和平滑肌細(xì)胞減少和正性重構(gòu)等〔7〕。近期有關(guān)易損斑塊動(dòng)物模型與急性冠脈綜合征患者的研究〔8〕發(fā)現(xiàn)，炎癥免疫機(jī)制、增殖凋亡機(jī)制、損傷應(yīng)激機(jī)制及生物力學(xué)機(jī)制參與了AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。IVUS可根據(jù)斑塊的回聲特點(diǎn)判斷其性質(zhì)，目前IVUS導(dǎo)管系統(tǒng)可以產(chǎn)生灰階IVUS和虛擬組織學(xué)(VH)-IVUS。VH-IVUS將識(shí)別富含脂質(zhì)壞死核的敏感性和特異性提高到91.7%和96.6%〔9〕。近期有關(guān)VH-IVUS的PROSPECT研究結(jié)果表明，通過(guò)VH-IVUS技術(shù)所確定的易損斑塊可以預(yù)測(cè)CHD患者主要心血管事件的發(fā)生率〔10,11〕。本研究提示C等位基因使得CHD的發(fā)生率明顯提高。PDGF-Drs7950273位點(diǎn)的基因多態(tài)性與易損斑塊直接相關(guān)，究其具體機(jī)制可能與C等位基因干預(yù)了PDGF-Drs7950273 蛋白翻譯效率,影響PDGF-D的表達(dá)有關(guān)。

綜上,PDGF-D基因的rs7950273的基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的IVUS顯像特征密切相關(guān)。新近研究〔12〕表明Trapidil和鈣離子阻滯劑可分別通過(guò)抑制PDGF受體磷酸化和PDGF介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增生阻止AS發(fā)生，減小內(nèi)膜斑塊面積。隨著分子心臟病學(xué)的深入研究，相信從分子水平進(jìn)行干預(yù)AS斑塊的治療策略將在未來(lái)實(shí)現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)4

1Hye Kim J,Gyu Park S,Kim WK,etal.Functional regulation of adipose-derived stem cells by PDGF-D〔J〕.Stem Cells,2015;33(2):542-56.

2張偉麗，惠汝太.動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病防治的新契機(jī)——遺傳學(xué)和基因組學(xué)的研究〔J〕.中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2009;9(1)：49-53.

3Wu Q,Hou X,Xia J,etal.Emerging roles of PDGF-D in EMT progression during tumorigenesis〔J〕.Cancer Treat Rev,2013;39(6):640-51.

4Keda T,Nakamura K,Akagi S,etal.Inhibitory effects of simvastatin on platelet-derived growth factor signaling in pulmonary artery smooth muscle cells from patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2010;55(1):39-48.

5Peden JF,Hopewell JC,Saleheen D,etal.A genome-wide association study in Europeans and South Asians identifies five new loci for coronary artery disease〔J〕.Nature Genet,2011;43(4)：339-44.

6Sathyanarayana S,Carlier S,Li W,etal.Characterisation of atherosclerotic plaque by spectral similarity of radiofrequency intravascular ultrasound signals〔J〕.Eurointervention,2009;5(1):133-9.

7Chen WQ,Zhang L,Liu YF,etal.Prediction of atherosclerotic plaque ruptures with high frequency ultrasound imaging and serum inflammatory markers〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007;293(5)：H2836-44.

8Ni M,Chen WQ,Zhang Y.Animal models and potential mechanisms of plaque destabilisation and disruption〔J〕.Heart,2009;95(17):1393-8.

9Nair A,Margolis MP,Kuban VD,etal.Automated coronary plaque characterisation with intravascular ultrasound backscatter：exvivo validation〔J〕.Eurointervention,2007;3(1):113-20.

10Kubo T,Maehara A,Mintz GS,etal.Analysis of the long-term effects of drug-eluting stents on coronary arterial wall morphology as assessed by virtual histology intravascular ultrasound〔J〕.Am Heart J,2010;159(2):271-7.

11Stone GW,Maehara A,Lansky AJ,etal.A prospective natural-history study of coronary atherosclerosis〔J〕.N Engl J Med,2011;364(3):226-35.

12Ozawa T,Brennan CW,Wang L,etal.PDGFRA gene rearrangements are frequent genetic events in PDGFRA-amplified glioblastomas〔J〕.Genes Develop,2010;24(19):2205-18.

〔2014-12-09修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：高靜(1979-)，女，博士，副教授，主要從事冠心病、高血壓研究。

基金項(xiàng)目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011HW075)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R541〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0073-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.031