趙娟娟 吳榮榮

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000)

發(fā)酵型核桃乳生產(chǎn)專用鏈球菌的選育

趙娟娟 吳榮榮

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000)

從發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、醬黃瓜中，分離到14株鏈球菌，經(jīng)過產(chǎn)酸特性測試，菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9適合核桃乳發(fā)酵。通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生化特性和16S rRNA 基因序列分析，確定4株鏈球菌均為嗜熱鏈球菌。采用菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9分別與實驗室保存的嗜酸乳桿菌 LA 共同發(fā)酵，發(fā)酵型核桃乳感官評價分別為96，91，93，86分；且4個發(fā)酵核桃乳中9種氨基酸都有不同程度的提高，其中HsS5氨基酸含量增幅最大，由0.67%增加到1.75%。綜上所述，菌株HsS5適宜核桃乳的發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)酵核桃乳；鏈球菌；分離；鑒定

核桃營養(yǎng)價值豐富，其中含有大量蛋白質(zhì)，較高的不飽和脂肪酸，豐富的維生素 B 和 E 及鈣、磷、鐵等多種人體需要的微量元素，常食用對動脈硬化、高血壓、抗衰老有良好的保健作用[1-2]。發(fā)酵型核桃乳是以核桃乳為原料，經(jīng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵來提高食品的營養(yǎng)價值，改善風(fēng)味，提高食品的保藏性和適口性。發(fā)酵過程中，核桃乳中的蛋白質(zhì)被分解成肽、氨基酸，礦物質(zhì)、B族維生素等物質(zhì)，賦予食品特殊的香氣和風(fēng)味，并增加了產(chǎn)品的腸道保健功能[3-5]。

目前關(guān)于發(fā)酵的核桃乳產(chǎn)品，主要是以牛乳或其他為主要原料，添加一定比例的核桃乳發(fā)酵制成發(fā)酵核桃酸奶。真正用純核桃乳發(fā)酵的很少，僅局限在配方上，且沒有研究純核桃乳的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，主要是由于缺少專門發(fā)酵純核桃乳的商品發(fā)酵劑。

本研究擬從不同來源的材料中分離鏈球菌，并通過形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA序列分析，確定其分類地位，將鑒定后的菌株進行產(chǎn)酸特性和核桃乳發(fā)酵試驗，從而確定適合核桃乳發(fā)酵的鏈球菌菌株[6]，旨在為發(fā)酵核桃乳產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、醬黃瓜：市售。

1.2 培養(yǎng)基

MC培養(yǎng)基：酵母粉3.0 g/L，牛肉粉3.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L，乳糖20.0 g/L，碳酸鈣10.0 g/L，1%中性紅溶液5.0 g/L，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入中性紅溶液。分裝后121 ℃高壓滅菌15～20 min。固體培養(yǎng)基需加入瓊脂1.3%～1.5%；

PY培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，胰酶水解酪蛋白5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，鹽溶液40.0 g/L，無水CaCl20.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.48 g/L，K2HPO41.0 g/L NaHCO310.0 g/L，NaCl 2.0 g/L。分裝后121 ℃高壓滅菌20 min；

碳水化合物發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，吐溫80 0.1 g/L，酵母膏2.5 g/L，1.6%的溴甲酚紫液1.0 g/L，分別按表1加入不同碳源，調(diào)pH=6.8，分裝試管后按其相應(yīng)的時間在114 ℃高壓蒸氣滅菌。

表1 碳水化合物發(fā)酵培養(yǎng)基

1.3 儀器與設(shè)備

PCR擴增儀：Takara Thermal Cycler Dice TP600型，日本TaKaRa公司；

電泳儀：Mupid型，美國Major Science公司；

電泳成像裝置：ImageMaster VDS型，安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司；

DNA測序儀：ABI PRISM3730XL DNA Sequencer型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

pH計：MP-6100型，鹽城澳鼎儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 鏈球菌的分離純化 上述的植物源產(chǎn)品過濾后吸取1 mL(面包為1 g)，用無菌生理鹽水按10倍稀釋至10-5，10-6，10-7。取0.1 mL稀釋液涂布在MC培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，劃線分離純化獲得菌株，經(jīng)鏡檢為純培養(yǎng)物后轉(zhuǎn)入固體斜面上，一部分于甘油保存，一部分在4 ℃冰箱中保存。

1.4.2 菌種的染色和形態(tài)觀察 將菌種接種于MC培養(yǎng)基上，觀察菌落的形態(tài)。用無菌接種環(huán)取一環(huán)菌染色后用油鏡進行觀察，觀察菌株的形態(tài)。

1.4.3 鏈球菌代謝特性

(1) 過氧化氫酶試驗：在MC培養(yǎng)基的菌落上滴加3%的H2O2，觀察有無氣泡產(chǎn)生。

(2) 精氨酸水解試驗：將1～2 d MC液體培養(yǎng)物接種于精氨酸水解的培養(yǎng)基，用無菌的石蠟礦物油密封，倒置37 ℃下培養(yǎng)72 h后，觀察結(jié)果。

(3) 七葉苷水解試驗：PY培養(yǎng)基中加入終濃度5 g/L的七葉苷，滅菌。將活化好的培養(yǎng)液接種于試管，37 ℃培養(yǎng)24～72 h后。取少量七葉苷培養(yǎng)液于比色盤內(nèi)，以未接種培養(yǎng)基作為對照，滴加少量檸檬酸鐵溶液，顯示黑色為陽性反應(yīng)，不顯色則為陰性反應(yīng)。

(4) 碳水化合物發(fā)酵試驗：按1%接種量，將活化好的培養(yǎng)液接種于不同碳水化合物的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～72 h。培養(yǎng)液變黃為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)[7-8]。

1.4.4 鏈球菌的16S rRNA基因序列測序

(1) 變性：從培養(yǎng)基中挑取菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件為80 ℃，15 min。

(2) PCR 擴增：使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)，進行 PCR 擴增。

(3) 測序：使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)切膠回收片段進行測序。

CTG497-S5以SEQ Forward、SEQ Internal和16S SEQF1為引物進行DNA測序；其余樣品均以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse為引物進行DNA測序。

1.4.5 核桃乳的發(fā)酵試驗及質(zhì)量評定

(1) 酸度測定：取乳樣10 mL，加入20 mL蒸餾水和2～3滴酚酞試劑，用標(biāo)定過的0.100 4 mol/L NaOH溶液進行滴定，酸度以吉爾涅爾度(T)表示。

(2) 感官評定：以色澤、香氣、滋味以及形態(tài)作為核桃乳感官評分指標(biāo)，邀請10人進行試飲評判。評分結(jié)果取其平均值計算。具體評定細(xì)則見表2。

表2 口感外觀評分的標(biāo)準(zhǔn)

(3) 氨基酸的評定：采用分離獲得的鏈球菌與實驗室保存的嗜酸乳桿菌LA，進行核桃乳發(fā)酵試驗，對發(fā)酵后氨基酸含量進行測定，并與未發(fā)酵核桃乳的營養(yǎng)質(zhì)量進行比對評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈球菌的分離

由表3可知，共分離到乳酸菌14株，其中來自市售泡菜的4株，占總分離菌株的29%；來自市售發(fā)酵面包的3株，占總數(shù)的21%；來自市售醬黃瓜的2株，占總數(shù)的14%；來自市售白芥絲的5株，占總數(shù)的36%。鏈球菌形態(tài)，主要以卵圓形，細(xì)胞的排列呈對狀、短鏈、中等長鏈、長鏈等不同的排列方式。

2.2 鏈球菌的初步篩選

將菌株為HsS1～HsS14分別與實驗室保存的嗜酸乳桿菌LA進行核桃乳發(fā)酵試驗，發(fā)酵產(chǎn)品酸度結(jié)果見表4。

由表4可知，經(jīng)過菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9分別和嗜酸乳桿菌LA共同發(fā)酵后，產(chǎn)品酸度分別為42，41，43，45T，經(jīng)過感官評分，認(rèn)為酸度在40～45T的樣品，酸甜可口，組織狀態(tài)均一，故可作為后續(xù)研究用菌株。

表3 鏈球菌形態(tài)特征

表4 核桃乳樣品酸度測定結(jié)果

2.3 鏈球菌的鑒定

2.3.1 鏈球菌的形態(tài)特征 由圖1～4可知，從發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、醬黃瓜等分離得到的鏈球菌株，細(xì)胞為球形或卵圓形，直徑0.7～0.9 μm，在顯微油鏡下細(xì)胞的排列呈對狀、短鏈、中等長鏈、長鏈等不同的排列方式。圓形菌落，深紅色，表面光滑，邊緣整齊，直徑約1 mm，革蘭氏陽性。

2.3.2 代謝特性試驗結(jié)果 將鏈球菌HsS5、HsS6、HsS8、HsS9按照文獻[9]677-679進行代謝特性的測定，結(jié)果見表5。

由表5可知，4株菌的過氧化氫酶試驗、精氨酸和七葉苷水解試驗陰性，淀粉試驗陽性；碳水化合物發(fā)酵試驗中葡萄糖、乳糖和蔗糖能被鏈球菌利用。以上的代謝特性與文獻[9]694所描述的嗜熱鏈球菌特征一致，因此初步鑒定4株鏈球菌為嗜熱鏈球菌。

圖1 HsS5的菌體和菌落形態(tài)

圖2 HsS6的菌體和菌落形態(tài)

圖3 HsS8的菌體和菌落形態(tài)

圖4 HsS9的菌體和菌落形態(tài)

2.3.3 16S rRNA基因特異性擴增結(jié)果 將4個菌株的16S rDNA 序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ，結(jié)果見圖5。

基因序列比對和分析結(jié)果為：菌株HsS5與嗜熱鏈球菌(FR875178.1)的片段相似性達到100%，菌株HsS6與嗜熱鏈球菌(HM059005.1)的片段相似性達到99%，菌株HsS8與嗜熱鏈球菌(HM058273.1)的片段相似性達到100%，菌株HsS9與嗜熱鏈球菌(CP002340.1)在66 845～68 289 bp的片段的相似性達到100%。結(jié)合菌株形態(tài)及代謝特性結(jié)果，確定HsS5、HsS6、HsS8、HsS9均為嗜熱鏈球菌。

表5 鏈球菌的代謝特性?

? +表示陽性；-表示陰性。

M. DNA Marker DL2 000 1. HsS5的16S rRNA基因 2. HsS6的16S rRNA 基因 3. HsS8的16S rRNA基因 4. HsS9的16S rRNA 基因 +. 陽性對照 -. 陰性對照

圖5 鏈球菌的16S rRNA基因

Figure 5 16S rRNA of streptococcus

2.4 鏈球菌的核桃乳發(fā)酵試驗

2.4.1 發(fā)酵核桃乳的感官評定結(jié)果 將菌株HsS5、HsS6、HsS8和HsS9與實驗室保存的嗜酸乳桿菌LA進行核桃乳發(fā)酵試驗，發(fā)酵后核桃乳樣品分別標(biāo)記為樣品5、6、8、9，感官評價結(jié)果見表6。

由表6可知，菌株HsS5與實驗室保存的嗜酸乳桿菌LA共同發(fā)酵的樣品5，具有核桃香氣，滋味酸甜適口、乳酸味濃且柔和，色澤略顯灰色，所形成的形態(tài)均勻一致。感官評定結(jié)果為96分，相比其它菌株的感官評分結(jié)果高。

表6 感官評分結(jié)果

2.4.2 發(fā)酵核桃乳的氨基酸測定結(jié)果 將菌株HsS5、HsS6、HsS8和HsS9與實驗室保存的嗜酸乳桿菌LA進行核桃乳發(fā)酵試驗，不同菌株發(fā)酵的核桃乳樣品的分別標(biāo)記為樣品5、6、8、9，氨基酸測定結(jié)果見表7。

表7 氨基酸測定結(jié)果

由表7可知，經(jīng)過發(fā)酵后的核桃乳的9種氨基酸含量均有不同程度的提高。其中經(jīng)菌株HsS5搭配嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵后賴氨酸的含量高達0.35%，是未發(fā)酵前賴氨酸含量(0.05%)的7倍；亮氨酸的含量，由原來的0.17%提高到了0.52%，是未發(fā)酵核桃乳的3倍；因此，菌株HsS5更適宜用在核桃乳發(fā)酵中。賴氨酸是核桃的第一限制性氨基酸，亮氨酸有助于血糖控制，重點考慮了這兩種，綜合感官評價分?jǐn)?shù)，選擇了HsS5。

3 結(jié)論

本研究從特定植物來源的材料中，采用選擇性分離培養(yǎng)基，獲得了HsS5、HsS6、HsS8、HsS9 4株鏈球菌菌株。通過生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，上述菌株均為嗜熱鏈球菌。對鑒定后的菌株進行發(fā)酵研究，結(jié)果表明，采用菌株HsS5與實驗室保存的嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵得到的純核桃發(fā)酵乳，感官評價最高，且具有較高的營養(yǎng)價值。后續(xù)將進一步分析純核桃發(fā)酵乳其它營養(yǎng)成分的指標(biāo)，促進該菌株的廣泛應(yīng)用。

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Screening of streptococcus used for the fermented walnut mink drink

ZHAO Juan-juanWURong-rong

(DepartmentofLifeScience,HengshuiUnivercity,Hengshui,Hebei053000,China)

In this study, 14Streptococcusstrains were isolated from sourdough bread, white silk mustard, pickles and cucumber sauce. Among those strains, four strains marked as HsS5, HsS6, HsS8, HsS9 could be used for the fermentation of the walnut milk after acid feature test, and they were identified asStreptococcusthermophilusthrough their morphologic, physiological biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence. The scores of sensory evaluation of these fermented walnut milks produced by HsS5, HsS6, HsS8, HsS9 withLactobacillusacidophilusLA were 96, 91, 93, 86, respectively. Moreover, the contents of nine kinds of amino acid were found increased at different degrees in these four kinds fermented walnut milk, especially in HsS5, increased most significantly from 0.67% to 1.75%. According to the above results, strain HsS5 was more valuable for fermented walnut milk production than other strains.

fermented walnut milk; streptococcus; separation; identification

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.013

趙娟娟(1982—)，女，衡水學(xué)院講師，碩士。 E-mail：zhaojuanjuan456@163.com

2016-05-13