迪麗阿熱姆·尼加提， 阿吉艾克拜爾·艾薩

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊　830011)

HPLC法測定阿圖什無花果葉汁中3種香豆素的含量

迪麗阿熱姆·尼加提1,2， 阿吉艾克拜爾·艾薩1,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的高效液相色譜法(HPLC法)測定阿圖什無花果葉汁中傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素3種香豆素的含量。方法色譜柱Sunfire C18ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速1 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫30℃，流動相為乙腈-水，流動相配比為0~10 min，乙腈25%；10~12 min，乙腈由25%梯度增至50%；12~20 min，乙腈50%；20~22 min，乙腈由50%梯度增至100%。結(jié)果傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素分別在0.001~0.019 mg/mL(R2=0.999 9)、0.01~0.19 mg/mL(R2=0.999 7)和0.01~0.19 mg/mL(R2=0.999 9)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均回收率分別為98.09%(RSD=0.85%)、102.07% (RSD=1.07%)和101.00%(RSD=0.71%)。阿圖什無花果葉汁中傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素3種香豆素的含量分別為1.09、9.89、24.58 mg/g。結(jié)論HPLC法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于測定無花果葉汁中傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素的含量。

關(guān)鍵詞：無花果葉汁； 香豆素； 高效液相色譜法

Determination of three coumarins in Ficuscarica L. Latex by HPLC methods

Dilaram Nijat1,2, Hajiakber Aisa1,2

(1SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity;2KeyLaboratoryofPlantResources

andChemistryinAridRegions,XinjiangTechnicalInstituteofPhysicsandChemistry,

ChineseAcademyofSciences,Urumqi, 830011,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of Umbelliferone, Bergapten and Psoralen in Ficuscarica Latex by HPLC method. MethodsHPLC method conditions and procedure: Sunfire C18ODS column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), with the flow rate of 1.0 mL/min, detectional wavelength at 220 nm under column temperature 30℃; acetonitrile-H2O as the mobile phase, 0~10 min, acetonitrile as 25%; afeter 10~12 min, acetonitrile as going up to 25%~50% gradually; 12~20 min, acetonitrile as 50%; 20~22 min, acetonitrile as going up to 50%~100% gradually. ResultsThere was a good linear relationship over the concentration range of (0.001~0.019) mg/ml, R2=0.999 9 for Umbelliferone, (0.01~0.19) mg/ml, R2=0.9997 for Bergapten and (0.01~0.19) mg/ml, R2=0.9999 for Psoralen. The average recovery rates of Umbelliferone, Bergapten and Psoralen were 98.09% (RSD=0.85%), 102.07% (RSD=1.07%) and 101.00% (RSD=0.71%), respectively. The contents of Umbelliferone, Bergapten and Psoralen were 1.09, 9.89 and 24.58 mg/g. ConclusionThe method is simple, accurate and stable, which could be applied to the determination of quality control.

Keyword:FicuscaricaL. Latex; Coumarins; HPLC

無花果，英文名為Fig，拉丁名為(Ficuscarica L.)，別稱映日果、奶漿果、蜜果，屬桑科榕屬落葉喬木或灌木。全株含白色乳汁，花隱于囊狀總花托內(nèi)，外觀只見果而不見花，故名無花果[1]。無花果原產(chǎn)于阿拉伯，后傳入敘利亞、土耳其、中國等國，在我國新疆、山東、廣西、江蘇、浙江、陜西等地栽培也較為廣泛。《本草綱目》[2]載：無花果“味甘、平、無毒，治五痔、咽喉痛”?！吨兴幋筠o典》[3]載：無花果“健胃清腸、消腫解毒，治腸炎、痢疾、喉痛、瘡癤疥癬”。國內(nèi)外研究表明無花果葉汁中含有20% 的白色膠狀物、70% 的水分、9% 的蛋白酶和1%其他[4]。通過GC-MS分析方法分析出無花果葉汁中含有大量的多酚化合物、甾體類和香豆素類化合物，并具有抵制人類癌細(xì)胞的抗癌活性[5]，對自由基1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)有清除活性，對人黑素瘤細(xì)胞A375有光毒性[6]，對山羊皰疹病毒有體外抗病毒活性[7]，對單純皰疹病毒(HSV-1)、艾柯病毒(ECV-11)和腺病毒(ADV)有抗病毒活性[8]。香豆素類化合物具有抗腫瘤活性[9-10]、抗真菌活性[11]、抗凝血作用[12]。

本研究對新疆阿圖什無花果葉汁甲醇提取浸膏的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，分離得到的主成分經(jīng)波譜分析鑒定為傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂素等香豆素類化合物。國內(nèi)外尚未見對無花果葉汁中香豆素的定性、定量方面的系統(tǒng)研究。本研究通過HPLC法測定無花果葉汁中傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素在甲醇提取物中的含量，旨在為阿圖什無花果葉汁藥用價(jià)值的開發(fā)、研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(e2695,Waters公司)，雙波長檢測器(2489型,Waters公司)，電子天平(LA12OS,Sartorius公司)，電熱恒溫干燥箱(DHG-9070A,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，冷凍干燥儀(FDU-2100,東京理化器械株式會社)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(SB-2000,上海愛明儀器有限公司)。

1.2試藥無花果葉汁采收于新疆阿圖什市松他克鄉(xiāng)阿孜汗村無花果果園，冷凍，備用。色譜級甲醇(默克公司，德國)，色譜級乙腈(默克公司，德國)，水為超純水。補(bǔ)骨脂素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110739)，佛手柑內(nèi)酯對照品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，批號14102708)，傘形花內(nèi)酯對照品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，批號14120715)。

2方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備將760 mL無花果葉汁用冷凍干燥儀冷凍干燥后，稱重122.63 g，干燥后的白色粉末用甲醇浸提72 h，精密稱取甲醇浸膏25.0 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得濃度為5.0 mg/mL的甲醇提取溶液，作為供試品溶液。

2.2色譜條件色譜柱 Sunfire C18ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速1 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 μL，流動相為乙腈-水，分離條件為：0~10 min，乙腈25%；10~12 min，乙腈由25%梯度增至50%；12~20 min，乙腈50%；20~22 min，乙腈由50%梯度增至100%，HPLC分析效果見圖1。

1： 傘形花內(nèi)酯； 2： 補(bǔ)骨脂素； 3： 佛手柑內(nèi)酯

圖13種香豆素對照品和無花果葉汁甲醇提取液HPLC分析圖

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察分別精密稱取傘形花內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品0.1、0.3、0.7、1.1、1.5、1.9 mg置100 mL容量瓶中，加無水甲醇定容，搖勻，制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密稱取佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品各0.1、0.3、0.7、1.1、1.5、1.9 mg置10 mL容量瓶中，加無水甲醇定容，搖勻，制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL，以濃度C為橫坐標(biāo)(X)，峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程分別為：Y=3.273 3X-0.003 2(R2=0.999 9)、Y=7.426 3X-0.130 9(R2=0.999 7)、Y=5.839 3X-0.034 9(R2=0.999 9)，表明傘形花內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.001~0.019 mg/mL范圍內(nèi)、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在0.01~0.19 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2精密度試驗(yàn)取傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，各標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，以測定的峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD值分別為1.76%、0.57%和0.63%，表明此方法精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取甲醇提取浸膏25.0 mg，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行6次HPLC分析，時(shí)間間隔為0、2、4、8、16、24 h。以傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素的含量為指標(biāo)計(jì)算RSD值分別為1.15%、0.98%和0.99%，說明24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)稱取甲醇提取浸膏6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測定含量。結(jié)果傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素的平均含量分別為1.06、10.50、27.18 mg/g，RSD值分別為1.61%、1.38%和1.09%。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素含量的甲醇提取浸膏各6份，對應(yīng)加入傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測定含量，計(jì)算平均回收率分別為98.09%、102.07%和100.99%，RSD值分別為0.85%、1.07%和0.71%，見表1。

表1　無花果葉汁甲醇提取部位中3種香豆素的加樣回收率試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果

2.4樣品含量測定分別精密稱取25.0 mg甲醇浸膏3份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，分別記錄3種香豆素的峰面積并用外標(biāo)法[13]計(jì)算含量，結(jié)果阿圖什無花果葉汁中傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素的含量分別為1.09、9.89、24.58 mg/g，見表2。

表2　無花果葉汁中3種香豆素的含量測定(n=3)

3討論

3.1樣品預(yù)處理方法無花果葉汁無使用鋼刀具、未經(jīng)擠壓收集后，立即放入-20℃保存，備用。通過冷凍干燥儀除去水分，用無水甲醇浸提。

3.2測定波長選擇無花果葉汁甲醇提取液通過二極管陣列檢測器全波長掃描，確定香豆素類化合物220 nm處有最大吸收。本實(shí)驗(yàn)選定220 nm作為檢測波長，在該波長下測定時(shí)，色譜峰對稱，干擾少。

3.3流動相考察考察考察甲醇-水及乙腈-水作為流動相的效果，乙腈-水作流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，雜質(zhì)峰較少，峰形好，因此選用乙腈-水作為流動相。

本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法測定阿圖什無花果葉汁中3種香豆素的含量方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速，3種香豆素對照品有良好的線性關(guān)系，并且2種供試品溶液的重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均為良好。本研究結(jié)果可為深入開發(fā)阿圖什無花果潛在的藥用價(jià)值、利用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)依據(jù)。

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(本文編輯施洋)

[收稿日期：2015-07-16]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.011

中圖分類號：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0052-04