朱惠斌，王雪平

（1．黃河水利職業(yè)技術學院，河南開封475004；2．開封市綠色涂層材料重點實驗室，河南開封475004）

香豆素及其衍生物是一類具有芳香性氣味的物質，廣泛存在于蕓香科、傘形科、菊科、豆科、瑞香科、茄科等高等植物及微生物的代謝產物中［1－4］。通常在化妝品中添加一定量的日用香精（由日用香料和輔料按一定配方調制而成的混合物），以賦予其溫馨、優(yōu)雅的香氣。但香豆素及其衍生物可能被添加在香水、沐浴啫喱、除臭劑等化妝品中。國際日化香料協(xié)會不推薦具有致敏作用的二氫香豆素、7－甲基香豆素、7－甲氧基香豆素等化合物作為日用香料成分使用；我國化妝品安全技術規(guī)范也明確規(guī)定環(huán)香豆素、4－甲基－7－乙氧基香豆素、7－甲氧基香豆素、7－甲基香豆素、二氫香豆素等香豆素及其衍生物為化妝品中的禁用物質［5－8］。

目前香豆素及其衍生物測定方法主要有氣相色譜法（GC）［9］、高效液相色譜法（HPLC）［10］、液相色譜－串聯(lián)質譜法（LC－MS／MS）［11－12］。本文采用堿性甲醇超聲提取香豆素及其衍生物，提取物采用Phenomenex Luna C18柱分離，以乙腈和0．1%NH4Ac溶液為流動相進行梯度洗脫，二極管陣列檢測器同時在280 nm、306nm和320nm波長檢測，建立了高效液相色譜法同時測定日用香精中10種香豆素及其衍生物的含量，為香豆素及其衍生物等禁用物質的監(jiān)督檢測提供技術支持。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

LC－20A型液相色譜儀（日本，島津公司），附二極管陣列檢測器（DAD）；JN－B－50型分析天平（上海圣科儀器設備有限公司）；YQ－1000C型超聲波清洗器（上海易凈超聲波儀器有限公司）；5427R型高速冷凍離心機（德國，Eppendorf公司）；ULUP－Ⅱ型超純水器（西安優(yōu)普儀器設備有限公司）。

香豆素及其衍生物標準品：香豆素（CM）、二氫香豆素（DDCM）、雙香豆素（DCM）、4－羥基香豆素（HOCM）、6－甲基香豆素（6MCM）、7－甲基香豆素（7MCM）、7－甲氧基香豆素（7MOCM）、7－乙氧基－4－甲基香豆素（EMCM）、醋硝香豆素（SCM）和環(huán)香豆素（PCM），純度均≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司。香豆素及其衍生物標準儲備液：準確稱取各香豆素及其衍生物標準品適量（精度0．1mg），用甲醇溶解配制濃度為10．0mg／mL的標準儲備液，－18℃保存。香豆素及其衍生物標準混合工作液：分別準確移取各香豆素及其衍生物標準儲備液各1．0mL于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，該溶液中10種香豆素類化合物的濃度均為200μg／mL，4℃保存。甲醇、乙腈均為色譜純，美國Tedia公司；HAc、NaOH為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實驗用水為超純水。

1．2 液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250×4．6mm，5μm）；流動相 A：乙腈；流動相B：0．1%NH4Ac溶液；流速：1．0mL／min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；檢測波長：280nm（香豆素、二氫香豆素、4－羥基香豆素、6－甲基香豆素、7－甲基香豆素），306nm（雙香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素）、320nm（7－甲氧基香豆素、7－乙氧基－4－甲基香豆素）。流動相梯度洗脫條件：初始條件80%B；0～40．0min，80%～65%B；40．0～50．0min，65%～30%B；50．0～56．0min，30%B；56．0～60．0min，80%B。

1．3 樣品前處理

稱取化妝品樣品2g（精度0．1mg）于10mL容量瓶中，加入6mL甲醇（含0．5%NaOH），渦旋振蕩30s，超聲提取20min，放至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻。轉移至15mL具塞塑料離心管中，10 000r／min離心5min，上清液經0．22μm濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

2 結果與討論

2．1 檢測波長的選擇

分別掃描10種香豆素及其衍生物標準溶液在190～800nm波長范圍紫外吸收光譜。結果表明：香豆素、二氫香豆素、4－羥基香豆素、6－甲基香豆素、7－甲基香豆素在280nm波長處，有最大吸收波長；雙香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素在306nm波長處，有最大吸收；7－甲氧基香豆素、7－乙氧基－4－甲基香豆素在320 nm波長處，有最大吸收。通過對實際樣品加標實驗發(fā)現(xiàn)，在280nm、306nm和320nm處檢測干擾峰較少，且其吸光度值與香豆素及其衍生物的含量呈正比關系，因此確定采用280nm、306nm和320nm作為檢測波長。

2．2 色譜柱及流動相的選擇

分別考察了 Waters Symmetry C18、Agilent XDB C18、Inertsil ODS C18、Phenomenex Luna C18、Diamonsil C18色譜柱對香豆素及其衍生物的分離效果。結果表明：采用Phenomenex Luna C18柱（250×4．6mm，5μm）時，10種香豆素及其衍生物的色譜峰分離效果好，且色譜峰響應值較高，峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象。實驗分別考察甲醇／乙腈－水、甲醇／乙腈－磷酸緩沖液、甲醇／乙腈－NH4Ac溶液等不同流動相體系。結果表明：采用甲醇－水、甲醇－磷酸緩沖液、甲醇－乙酸銨為流動相時，基線漂移嚴重，色譜峰不能實現(xiàn)有效分離；采用乙腈－水作為流動相時，基線較平穩(wěn)，色譜峰響應值較高，但雙香豆素、醋硝香豆素和4－羥基香豆素色譜峰拖尾；采用乙腈－0．1%NH4Ac溶液作為流動相，梯度洗脫，香豆素及其衍生物分離效果較好，各色譜峰響應值較高。因此選擇乙腈－0．1%NH4Ac溶液作為流動相。優(yōu)化色譜條件見1．2節(jié)，所得色譜圖見圖1。

圖1 香豆素及其衍生物標準溶液的色譜圖Fig．1 Chromatograms of coumarin and its derivatives

2．3 提取溶劑的選擇

根據(jù)香豆素及其衍生物的溶解特性，分別考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等有機溶劑的提取效率。結果表明：采用甲醇作為提取溶劑，雖然大部分香豆素及其衍生物的回收率較高，但二氫香豆素、環(huán)香豆素的回收率＜85%；采用甲醇（含0．5%NaOH）作為提取溶劑，10種香豆素及其衍生物，回收率平均值為95．6%。因此，實驗選擇甲醇（含0．5%NaOH）作為提取溶劑。

2．4 線性關系、檢出限和定量限

按上述所建 HPLC法，對質量濃度分別為0．5、1．0、5．0、10．0、25．0、50．0、100．0μg／mL的香豆素及其衍生物混合標準溶液進行測定，以目標物色譜峰峰面積（y）對質量濃度（x，μg／mL）進行線性回歸，繪制標準曲線。從表1中可知：香豆素及其衍生物在1．0～100．0μg／mL質量濃度范圍內，線性關系良好，相關系數(shù)（r2）在0．9997～0．9999之間。

在空白日用香精中添加一系列低濃度的香豆素及其衍生物混合標準溶液，HPLC法重復測定11次，分別以3倍信噪比（S／N＝3）和10倍信噪比（S／N＝10）作為檢出限（LODs）和定量限（LOQs）。從表1中可知：10種香豆素及其衍生物LODs為在0．15～0．90mg／kg，LOQs為0．45～3．0mg／kg。

表1 線性方程、相關系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 1 Linear equation，correlation coefficient（r2），limits of detection（LODs）and limits of quntification（LOQs）

2．5 回收率和精密度

在空白日用香精中分別添加低、中、高3個濃度水平的香豆素及其衍生物混合標準溶液，進行加標回收率和精密度測定。結果顯示：平均加標回收率在90．1%～98．3%范圍，相對標準偏差（RSD）為1．1%～4．6%。

2．6 實際樣品的測定

隨機選取市售15份日用香精實際樣品，按上述HPLC法測定樣品中香豆素及其衍生物的含量。結果表明：2份樣品中檢出含有香豆素和4－羥基香豆素，其檢出最高含量分別為58．3mg／kg和127．3mg／kg。這表明目前市售日用香精中某些廠家非法添加香豆素或其衍生物，政府行政監(jiān)管部門應加強對其日常監(jiān)督監(jiān)測。

3 結論

本文建立了高效液相色譜法測定日用香精中10種香豆素及其衍生物含量的分析方法，結果表明，該方法操作簡單、回收率高、精密度好，適用于日用香精中香豆素及其衍生物的日常檢測。